南葶苈子提取物对哮喘大鼠肺组织中CyclinD1、PI3K表达的影响

林 红， 张 玲

(连云港市中医院药学部，江苏 连云港 222004)

支气管哮喘是由多种细胞(如气道上皮细胞、中性粒细胞、T淋巴细胞、肥大细胞、嗜酸性粒细胞等)参与的气道慢性炎性反应，临床特征主要为可逆性气道阻塞、气道重建、气道高反应性[1-2]。随着环境污染的加重，支气管哮喘发病率及病死率逐年攀升，严重威胁现代人类健康。近年来，中医药在哮喘病理生理、实验研究中取得了一定进展，且不少中药在哮喘治疗过程中发挥良好效果[3-4]。南葶苈子始载于《神农本草经》，为十字花科植物播娘蒿DescurainiaSophia(L.)Webb ex Prantl的干燥成熟种子，具有行水消肿，泻肺平喘之功效。现代研究表明，葶苈子总黄酮有拮抗血小板激活因子作用[5]，并对大鼠气道平滑肌细胞增殖有抑制作用[6]。以葶苈子为君药的复方蠲哮汤为治疗哮喘痰瘀伏肺的安全有效方剂[7]。尽管不少研究表明南葶苈子提取物对哮喘有一定治疗效果，但具体作用机制研究尚不明确。以往研究表明，磷脂酰肌醇3激酶(phosphoinositide 3 kinase，PI3K)信号通路介导的细胞因子和炎性递质[8]，以及CyclinD1具有诱导平滑肌细胞增殖的作用[9]。因此，本研究通过检测南葶苈子提取物对哮喘大鼠肺组织中CyclinD1蛋白表达、PI3KmRNA表达的影响，以期探究南葶苈子提取物对哮喘大鼠的起效机制。

1 材料

1.1 动物 100只SPF 级SD雄性大鼠，10周龄，体质量(200±20)g，购自南京大学-南京生物医药研究院，实验动物生产许可证号SCXK(苏)2015-0001。

1.2 试剂与药物 南葶苈子，由连云港市中医院药学部副主任中药师林红鉴定为正品。卵蛋白(美国Sigma公司)；PI3K引物由英潍捷基(上海)贸易有限公司合成；山羊血清、氯化三苯基四氮唑、苏木素均购自武汉赛维尔生物科技有限公司。

1.3 仪器 RM2235型石蜡切片机(德国Leica公司)；BC-20 S型全自动血细胞计数仪(深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司)；X100型电子显微镜(日本奥林巴斯公司)；PRISM 7000型Real time PCR仪(美国ABI公司)。

2 方法

2.1 南葶苈子提取物制备 取200 g南葶苈子，打粉过筛后，加8倍量蒸馏水于70 ℃提取3次，每次1 h，合并滤液，减压浓缩至100 mL，即得南葶苈子水提物；另取200 g南葶苈子，打粉过筛后，加8倍量75%乙醇回流提取3次，每次1 h，合并滤液，旋蒸至无醇味，定容至100 mL，即得南葶苈子醇提物。

2.2 分组及造模 参考文献[10]报道，大鼠适应性饲养1周后，随机分为空白组、模型组、地塞米松组、南葶苈子醇提物组、南葶苈子水提物组，每组20只。除空白组外，其余各组均建立哮喘模型。实验第1、8天腹腔注射1 mL 10%卵蛋白致敏，自第15天起，每天以1%卵蛋白雾化30 min进行激发，同时每天将大鼠放入0～2 ℃寒冷箱中2 h，共持续7 d，直至大鼠出现口唇发绀、腹肌抽搐、呼吸急促、站立不稳、畏寒肢冷等症状，并取各组大鼠肺泡灌洗液，低速离心，PBS重悬，经涂片、染色后计数细胞总数，并计算其中嗜酸性粒细胞、中性粒细胞及淋巴细胞百分比，若上述各指标升高，符合炎性改变, 则认为哮喘模型建立成功。空白组用生理盐水代替卵蛋白进行致敏、激发，不用寒冷刺激。

2.3 给药 各给药组均于造模开始第21天灌胃给药，地塞米松组给予0.4 mg/kg地塞米松片(研碎后溶于生理盐水)，南葶苈子水提物、醇提物组给予南葶苈子水提物、醇提物 10 g/kg，空白组和模型组给予等量生理盐水，每天1次，连续8周。灌胃期间，大鼠自由进食、饮水，每周称定体质量1次，根据体质量变化调整给药量。

2.4 免疫组化法检测肺组织中CyclinD1蛋白表达 大鼠于给药前和末次给药后禁食12 h后取材。参考文献[11]报道，大鼠以10%水合氯醛麻醉后，断头处死，取左上肺，浸泡在10%甲醛溶液中固定，密封好并标记，剩余肺组织液氮冻存。制作石蜡切片后，常规脱蜡，滴加3%过氧化氢室温静置15 min，PBS洗涤3次，加山羊血清封闭液孵育30 min，加一抗4 ℃孵育过夜，次日加生物素标记的二抗37 ℃孵育30 min，PBS洗涤3次，2% 2，3，5-氯化三苯基四氮唑染色10 min，PBS洗涤3次，苏木素复染，光学显微镜400倍下观察CyclinD1分布强度，其中细胞质或细胞核出现棕黄色为阳性，采用阳性细胞半定量分级法统计染色结果，计算百分率。

2.5 RT-qPCR法检测大鼠肺组织中PI3KmRNA表达 参考文献[12]报道，取适量肺组织，采用TRIzol法提取总RNA，通过HD-3000核酸蛋白检测(上海楚定分析仪器有限公司)确定总RNA纯度与浓度，若纯度比值在1.8～2.0间认为纯度适合。按照Bestar qPCR RT Kit说明书，以1 g总RNA为模板反转录为cDNA。PI3K正向引物序列5′-AAGAAGCTGAACGAATGGTTG-3′，反向引物序列5′-GGTGGCAGTCTTGTTGATGAC-3′，PCR扩增反应条件为95 ℃保持5 min，94 ℃保持30 s，55～65 ℃保持30 s，72 ℃保持1 min，共40个循环。以2-ΔΔCT法计算PI3KmRNA相对表达量。

3 结果

3.1 南葶苈子提取物对大鼠肺泡灌洗液中嗜酸性粒细胞、中性粒细胞及淋巴细胞比例的影响 给药前，模型组及各给药组大鼠肺泡灌洗液中嗜酸性粒细胞、中性粒细胞及淋巴细胞比例均高于空白组(P<0.05)；给药后，各给药组大鼠肺泡灌洗液中嗜酸性粒细胞、中性粒细胞及淋巴细胞比例均低于给药前(P<0.05)，且低于模型组(P<0.05)，见表1。

表1 南葶苈子提取物对大鼠肺泡灌洗液中嗜酸性粒细胞、中性粒细胞及淋巴细胞比例的影响

3.2 南葶苈子提取物对大鼠肺组织中CyclinD1蛋白表达的影响 给药前，模型组及各给药组大鼠肺组织中CyclinD1蛋白表达均高于空白组(P<0.05)；给药后，各给药组大鼠肺组织中CyclinD1蛋白表达均低于给药前(P<0.05)，且低于模型组(P<0.05)，见表2。

表2 南葶苈子提取物对大鼠肺组织中CyclinD1蛋白表达的影响

3.3 南葶苈子提取物对大鼠肺组织中PI3KmRNA表达的影响 给药前，模型组及各给药组大鼠肺组织中PI3KmRNA表达均高于空白组(P<0.05)；给药后，各给药组大鼠肺组织中PI3KmRNA表达均低于给药前(P<0.05)且低于模型组(P<0.05)，见表3。

表3 南葶苈子提取物对大鼠肺组织中PI3K mRNA表达的影响

4 讨论

支气管哮喘属中医学“哮病”范畴，中医理论认为哮病因“内有壅塞之气，外有非时之感，膈有胶固之痰” 所致，其中“痰瘀伏肺”为哮喘的根本原因[13-14]，不少医者采用治痰瘀的中药改善哮喘症状。本研究选用的南葶苈子是痰瘀伏肺良药，但其具体作用机制尚不明确。

以往研究表明，CyclinD1在正常细胞中与细胞增殖有关，能够促进细胞周期[15-16]。在大鼠肺发育过程中，CyclinD1集中表达于气道平滑肌细胞中，在调节细胞G1期向S期转变过程中起关键作用[17]。不少研究证实，气道平滑肌细胞增殖是哮喘发生的重要机制之一[18-19]。因此，下调CyclinD1表达，对影响气道平滑肌细胞增殖，改善气道重塑有直接作用。本研究发现，模型组肺组织中CyclinD1表达高于空白组；南葶苈子提取物可降低肺组织中CyclinD1表达；此外，南葶苈子提取物组与地塞米松组给药后CyclinD1表达组间差异无统计学意义，说明两者对CyclinD1表达的下调作用相当。

PI3K信号通路参与气道平滑肌细胞增殖过程，PI3KmRNA通过介导细胞因子、炎性递质、生长因子等促进气道平滑肌细胞增殖，因此，PI3K信号通路在哮喘气道重塑及哮喘气道高反应性过程中发挥重要作用[20-21]。本研究结果显示，模型组给药前肺组织中PI3KmRNA表达高于空白组，提示哮喘发生时肺组织PI3KmRNA处于激活水平；南葶苈子提取物可降低肺组织中PI3KmRNA表达；南葶苈子提取物PI3KmRNA表达与地塞米松组比较差异无统计学意义，提示南葶苈子提取物对PI3KmRNA抑制作用与地塞米松相当。此外，研究发现不同方法提取的南葶苈子提取物对哮喘大鼠肺组织中CyclinD1蛋白表达、PI3KmRNA表达抑制效果相似，提示醇提取法和水提取法对南葶苈子有效成分的影响相差较小。

综上所述，南葶苈子提取物可以有效抑制哮喘大鼠肺组织中CyclinD1蛋白、PI3KmRNA表达，抑制气道平滑肌细胞增殖，从而起到抑制气道重塑的作用。