关白附对大鼠心脏毒性的研究

徐小颖， 逄 健， 张北雪， 马善鹏， 姜宇珺， 才 谦

(辽宁中医药大学药学院，辽宁 大连 116600)

关白附为毛茛科植物黄花乌头Aconitumcoreanum(Lévl.) Rapaics的干燥块根及根茎[1]，其味辛、甘，有毒，归肝、胃经，具有祛风痰、定惊痫、散寒止痛等功效，主治中风癫痫、口眼歪斜、偏正头痛等疾病[2]。乌头属植物中双酯型的二萜类生物碱具有很强的毒性，其主要表现为神经和心脏毒性。乌头属植物会兴奋心脏的迷走神经，造成窦房结自律性和传导性降低，可能引起房室传导阻滞，并有可能会直接作用于心肌细胞而导致死亡[3-5]。近年来，乌头属类药物中毒事件时有发生，关白附未被收录在2020年版《中国药典》中，关于关白附的心脏毒性相关实验研究较少，本实验通过给予大鼠关白附混悬液，考察其对大鼠的心脏毒性。此外，附子作为明确具有心脏毒性的乌头属中药，应用后的不良反应主要表现在对心脏和神经的损害[6]。本实验采用附子对大鼠的心脏毒性作为对比，将附子的心脏毒性作为参考来考察关白附的心脏毒性大小。根据2020年版《中国药典》中附子的临床使用剂量，本实验选择低剂量附子组进行大鼠的心脏毒性实验，使其与关白附低剂量组相对应，并设置不同剂量关白附组，通过相关生化指标、病理学变化的情况来考察关白附对心脏毒性是否具有剂量依赖性，以期为关白附临床合理用药提供参考。

1 材料

1.1 药材 关白附Aconitumcoreanum(Lèvl.) Rapaics购于辽宁西丰，生附子购于安徽亳州，以上药材均为当地农户栽培，经辽宁中医药大学药用植物教研室许亮教授鉴定为正品。

1.2 动物 健康雄性SPF级别SD大鼠50只，体质量180～220 g，购自辽宁长生生物技术股份有限公司，实验动物生产许可证号SCXK(辽)2015-0001。在温度22～23 ℃、相对湿度40%～70%条件下适应性饲养7 d，自由饮水饮食。

1.3 仪器 Fresco型台式冷冻离心机(德国Heraeus公司)；CP225D型电子天平(北京赛多利斯仪器系统有限公司)；KH-300B型超声波清洗器(昆山禾创超声仪器有限公司)；RM6240型多道生理信号采集处理系统(成都仪器厂)。

1.4 试剂 肌酸激酶(CK)ELISA试剂盒、乳酸脱氢酶(LDH)ELISA试剂盒、B型脑钠肽(BNP)ELISA试剂盒、羟丁酸脱氢酶(HBDH)ELISA试剂盒(上海科兴生物科技有限公司，批号191125N)；4%组织细胞固定液(大连海晨贸易有限公司，批号P1110)。

2 方法

2.1 药物制备及给药剂量 分别称取关白附粉末1.25、3.75、11.25 g(过170目筛)，加入20 mL蒸馏水，配制成质量浓度为0.062 5、0.187 5、0.562 5 g/mL的混悬液；称取附子粉末1.875 g(过170目筛)，加入20 mL蒸馏水，配制成质量浓度为0.093 75 g/mL的混悬液，所有药液均现用现配。参照2020年版《中国药典》[7]附子常用剂量为3～15 g，《现代中药学大辞典》收载的关白附临床剂量为6 g，按体表面积法折算大鼠附子等效给药剂量为0.937 g/kg，关白附低、中、高剂量为0.625、1.875、5.625 g/kg(约临床等效剂量的1、3、9倍)。

2.2 分组及给药 将雄性SPF级SD大鼠随机分成空白组，关白附低、中、高剂量组，附子组，每组10只。除空白组外，其余各组大鼠分别灌胃给予附子混悬液及关白附低、中、高剂量混悬液，大鼠灌胃容量为10 mL/kg，空白组大鼠灌胃给予等体积生理盐水，每天1次，连续14 d。

2.3 大鼠心电图检测 在大鼠末次给药后1 h，腹腔注射10%水合氯醛(3 mL/kg)麻醉大鼠，仰面固定在实验台上，使用生物信号采集系统采集大鼠的心电图信号，将正负电级分别插入大鼠右上肢和左下肢，将底线插入大鼠的右下肢，记录各组大鼠30、45、60 min时Ⅱ导联的心电图，记录其P波、T波、PR间期、QT间期、QRS间期和大鼠的心率情况[8]。

2.4 HE染色观察大鼠心脏组织病理学变化 停止心电图采集后，大鼠经腹主动脉取血，在4 ℃、4 000 r/min条件下离心10 min，分离取血清，放置于-20 ℃保存待测。立即取出大鼠心脏，使用预冷生理盐水将表面的血污冲洗干净，用滤纸吸干心脏表面的水分，称定心脏质量，计算心脏指数，公式为心脏指数=心脏质量/体质量[9]；取部分心脏组织，于4%中性甲醛溶液固定，常规石蜡包埋，切片(5 μm)，HE染色，在光学显微镜下观察病理改变情况[10]。对心脏组织病理切片进行半定量分析，以炎性细胞对心肌细胞浸润作为评价指标，无炎性细胞浸润记为0分；偶见或者少数炎性细胞浸润记为1分；中等数量的炎性细胞浸润记为2分；大量炎性细胞浸润记为3分[11]。

2.5 ELISA法检测大鼠血清BNP水平和CK、LDH、HBDH活性 严格按照相关试剂盒说明书检测各组大鼠血清B型脑钠肽(BNP)水平和肌酸激酶(CK)、乳酸脱氢酶(LDH)、羟丁酸脱氢酶(HBDH)活性。

3 结果

3.1 关白附对大鼠心电图的影响 灌胃给药30 min后，与空白组比较，附子组大鼠T波振幅、QRS间期、S-T波间期以及大鼠心率升高(P<0.05)，关白附低剂量组大鼠心率升高(P<0.05)，关白附高剂量组大鼠T波振幅、S-T波间期、心率升高(P<0.05)，提示关白附的毒性作用存在一定量效关系；与附子组比较，关白附低剂量组大鼠S-T波间期降低(P<0.05)。灌胃给药45 min后，与空白组比较，附子组大鼠P波振幅、QRS间期、S-T波间期、心率升高(P<0.05)，关白附低剂量组大鼠心率升高(P<0.05)，关白附高剂量组大鼠T波振幅、S-T波间期、心率升高(P<0.05)；与附子组比较，关白附低剂量组大鼠P波振幅、S-T波间期、心率降低(P<0.05)。灌胃给药60 min后，与空白组比较，附子组大鼠QRS间期、S-T波间期、大鼠心率升高(P<0.05)，关白附低剂量组大鼠QRS间期降低(P<0.05)，关白附低、高剂量组大鼠心率升高(P<0.05)；与附子组比较，关白附低剂量组大鼠S-T间期、心率降低(P<0.05)。由表1～3可知，各剂量关白附均可引起大鼠的心电图异常，但从心电图变化没有看出明显的量效关系，低剂量关白附组与等效剂量附子组比较，附子毒性表现明显，关白附毒性较小。

表1 各组大鼠30 min心电图

表2 各组大鼠45 min心电图

表3 各组大鼠60 min心电图

3.2 关白附对大鼠心脏指数、血清BNP水平及CK、LDH、HBDH活性的影响 与空白组比较，附子组和关白附高剂量组大鼠心脏指数和血清LDH、HBDH活性升高(P<0.05)，关白附低剂量组大鼠血清HBDH活性升高(P<0.05)，关白附中剂量组大鼠血清LDH、HBDH活性升高(P<0.05)；与附子组比较，关白附低剂量组大鼠血清LDH、HBDH活性降低(P<0.05)，关白附高剂量组大鼠血清HBDH活性降低(P<0.05)，见表4。提示，关白附能对大鼠血清生化指标产生影响，且呈剂量依赖性，与等效剂量的附子比较，低剂量关白附毒性较小。

表4 关白附对大鼠心脏指数、血清BNP水平及CK、LDH、HBDH活性的影响

3.3 关白附对心脏病理组织形态学的影响 空白组大鼠心肌整体着色较均匀，心肌纤维排列整齐有序，肌丝粗细相对均匀，没有明显炎性细胞浸润；附子组大鼠心肌着色不均匀，心肌纤维排列紊乱，且间隙较宽，肌丝的粗细不等，部分区域的肌纤维有溶解、萎缩现象，伴有少量的出血；关白附低、中剂量组大鼠心肌纤维排列较整齐，心肌纤维间隙和肌丝粗细较均匀，仅见个别有炎性细胞的浸润；关白附高剂量组大鼠心肌纤维排列紊乱，并伴有肌浆溶解，心肌纤维之间的间隙明显增宽，肌丝粗细不等，间质血管有扩张现象，且伴有少量的出血，见图1、表5。

表5 关白附对大鼠心脏组织病理变化的影响

4 讨论

根据《神农本草经》等古籍的记载，毛茛科乌头属植物具有毒性，近些年来中毒事件也时有发生[12]。因此，合理使用乌头属药材，需要对其毒性进行更深入的研究。毛茛科乌头属植物是一类重要的药用植物，具有较高的药用价值，其主要有效成分是二萜类生物碱，乌头类生物碱有抗心律失常和强心作用，但又表现出心脏毒性和神经毒性。临床使用乌头属药材治疗疾病必须充分考虑临床用药的安全性。

临床上通常用功能学和形态学进行心脏毒性的评价，功能学主要分为心电图、心电向量图和心阻抗血流图，形态学主要包括心肌组织的形态学和心肌细胞超微结构的观察[13]。本实验从大鼠的心电图，血清BNP水平和CK、LDH、HBDH活性以及心肌组织病理切片来观察关白附连续给药14 d对大鼠心脏毒性的影响，并且将低剂量关白附与等效剂量附子对大鼠心脏毒性进行比较。心电图数据显示，空白组大鼠心电图均表现正常；与空白组比较，附子组大鼠心电图出现心率加快、抬高S-T段，引起P波振幅、T波振幅和QRS波群等改变；关白附低剂量组大鼠心电图出现异常，但心律失常现象不明显，提示附子和关白附均能对大鼠造成心肌损伤，但与附子比较，等效剂量(低剂量)关白附对大鼠的心脏毒性较小。附子组和关白附各剂量组大鼠心率加快，其中附子组大鼠心率加快情况最明显，关白附各剂量组随着给药剂量增加，心率呈加快趋势，提示关白附心脏毒性呈剂量依赖性。

观察大鼠心脏病理切片发现，附子组和关白附各剂量组大鼠均有心脏损伤，但关白附低、中剂量组大鼠心脏损伤较小，没有明显的病理改变，而高剂量组大鼠心肌组织有明显病理改变。与关白附低剂量比较，等效剂量附子对大鼠心脏有明显的病理损伤。

LDH、CK、BNP、HBDH是临床上几种缺血性心脏病经典的生化标记物，参与疾病发生和发展过程，可以作为临床上评估心脏疾病危险性的重要信息，并为患者预后情况的变化提供重要预示[14-15]。本研究结果显示，附子组和关白附各剂量组大鼠血清LDH、HBDH活性均高于空白组，提示附子和关白附均能对大鼠心肌细胞产生一定的毒副作用；但与等效剂量附子比较，低剂量关白附对大鼠的心脏毒性较小。

综上所述，关白附对大鼠心脏存在毒性影响，但与附子相比，关白附的心脏毒性较小。此外，关白附心脏毒性存在剂量依赖性，病损程度随着剂量的增加而加重。本实验通过关白附对大鼠心脏毒性效应的研究，为关白附临床安全用药提供一定参考。