王枣子叶总黄酮的降糖活性研究

曹稳根， 史晔瑶， 王 晴， 张 颖， 段 红， 翟科峰

(宿州学院生物与食品工程学院，安徽 宿州 234000)

糖尿病是一种常见的内分泌代谢紊乱疾病，现已成为继心脑血管疾病、癌症之后严重危害人类健康的第三大疾病，其中2型糖尿病约占糖尿病总数的90%。糖尿病危害极大，目前仍缺乏安全性和依从性高且长效的治疗方法。研究表明，从中草药中提取的有效成分对调节血糖和防治糖尿病及其并发症都有特殊的疗效，日益受到国内外学者高度关注[1-3]。黄酮类化合物是一类广泛存在于植物次生代谢产物中的生物活性小分子化合物，在自然界中存在形式多样，大量研究证实，黄酮类化合物具有降糖等多种药理作用[4-14]。

王枣子Isodonamethystoides(Benth) Cy Wu et Hsuan为唇形科香茶菜属多年生草本植物，全草皆可入药，为皖北地区的道地药材，2014年9月“宿州王枣子” 获国家工商总局商标局核准注册中药材地理标志商标[15]。研究表明，王枣子叶含有丰富的黄酮类物质[16-18]，但有关王枣子叶总黄酮的降糖活性研究未见报道。在课题组前期研究的基础上，本研究通过α-葡萄糖苷酶活性抑制实验探讨王枣子叶总黄酮体外降糖活性。采用四氧嘧啶糖尿病小鼠模型，经王枣子叶总黄酮不同剂量组连续灌胃4 周，检测不同时间段小鼠空腹血糖、口服糖耐量以及血清总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)水平的变化，探讨其体内降糖活性，以期为道地药材王枣子总黄酮有效成分的开发与利用提供科学实验依据。

1 材料

1.1 试剂与药物 王枣子叶(宿州绿源中医药科技有限公司)，经安徽中医药大学药学院周建理教授鉴定为正品。芦丁对照品(上海源叶生物科技有限公司，批号Y01D8S49613)；α-葡萄糖苷酶、对硝基-α-D-吡喃葡萄糖苷(美国Sigma公司，批号L25 M9Y62118、E1828029)；四氧嘧啶[阿拉丁试剂(上海)有限公司，批号H1808033]；阿卡波糖(杭州中美华东制药有限公司，批号1809224)；盐酸二甲双胍片(上海上药信谊药厂有限公司，批号48181223)；DS-3乐生邦德血糖试纸(上海盛邦生物科技有限公司，批号KSB1726A2)；TC、TG、HDL-C试剂盒(南京建成生物工程研究所)。其他试剂均为分析纯。

1.2 仪器 DS-3型乐生邦德血糖测试仪(上海盛邦生物科技有限公司)；Multiskan GO型酶标仪(美国Thermo公司)；ST3100型实验室PH计[奥豪斯仪器(上海)有限公司]；723型可见分光光度计(上海光谱仪器有限公司)；JY96-IIN型超声波细胞粉碎机(宁波新芝生物科技股份有限公司)；HK-04A200 g型手提式粉碎机(广州市旭朗机械设备有限公司)；R-1001LN型旋转蒸发仪(郑州长城科工贸有限公司)。

2 方法

2.1 王枣子叶总黄酮制备与纯化 将新鲜王枣子叶去杂质后置于55 ℃烘箱中干燥2 h，粉碎过80目筛备用，通过纤维素酶-超声提取方法得到王枣子叶总黄酮粗提液，得率为13.92%[18]，再经过AB-8大孔树脂纯化[19]得王枣子叶总黄酮纯化液，备用。

2.2 王枣子叶总黄酮体外抑制α-葡萄糖苷酶活性的检测 参考文献[10]报道方法进行检测，以阿卡波糖为阳性对照，王枣子叶总黄酮对α-葡萄糖苷酶抑制率计算公式为抑制率=[1-(A-B)/(C-D)]×100%，A为样品组(酶液+样品)测得的吸光度值；B为样品空白组(磷酸盐缓冲液+样品)测得的吸光度值；C为阴性对照组(酶液+溶剂)测得的吸光度值；D为空白组(磷酸盐缓冲液+溶剂)测得的吸光度值。

2.3 王枣子叶总黄酮对四氧嘧啶型糖尿病小鼠降糖活性的检测

2.3.1 糖尿病小鼠模型的建立 选取健康雄性ICR小鼠90只，体质量 (25±2) g，适应性饲养3 d后，取10只小鼠作为正常组，其余80只小鼠禁食24 h(自由饮水)后，腹腔一次性注射2%四氧嘧啶生理盐水(150 mg/kg)进行造模。5 d后，小鼠禁食4 h，尾静脉取血测量空腹血糖，血糖值>11 mmol/L判定为造模成功。

2.3.2 分组及给药 选取造模成功的ICR小鼠50只，随机分成5组，即模型组，阳性对照组(100 mg/kg二甲双胍)，王枣子叶总黄酮低、中、高剂量组(100、150、200 mg/kg)，给药组灌胃给予相应剂量药物，模型组和正常组灌胃给予等量生理盐水，每天定时给药3次，每次0.2 mL，连续4周。

2.3.3 血糖检测 分别在0、7、14、21、28 d，空腹尾静脉采血，用血糖仪测量每组小鼠血糖值。

2.3.4 口服糖耐量检测 参考文献[2]报道方法进行检测。于第28天将小鼠禁食12 h，检测其血糖(0 min)，然后灌胃2.0 g/kg葡萄糖溶液，分别在30、60、90、120 min检测小鼠血糖。

2.3.5 血清TC、TG、HDL-C水平检测 28 d后，小鼠摘眼球采血，分离取血清备用，按试剂盒说明书检测TC、TG、HDL-C水平。

3 结果

3.1 王枣子叶总黄酮体外对α-葡萄糖苷酶活性的影响 如图1所示，在质量浓度0.1～0.5 mg/mL范围内，王枣子叶总黄酮对α-葡萄糖苷酶具有较强的抑制活性，且呈量效关系。当质量浓度为0.5 mg/mL时，王枣子叶总黄酮对α-葡萄糖苷酶抑制率达到73.3%，略低于阿卡波糖，是良好的α-葡萄糖苷酶抑制剂。

3.2 王枣子叶总黄酮对小鼠血糖的影响 如图2所示，给药0 d，与正常组比较，模型组及各给药组血糖值升高(P<0.01)；与模型组比较，阳性对照组以及王枣子叶总黄酮各剂量组小鼠14、21、28 d血糖均降低(P<0.05，P<0.01)，其中王枣子叶总黄酮低剂量组降糖效果较好。

3.3 王枣子叶总黄酮对小鼠糖耐量的影响 如图3所示，与正常组比较，模型组及各给药组小鼠血糖值在灌胃葡萄糖30 min后达到高峰，之后开始下降，但在120 min内仍处于较高水平(P<0.05)；与模型组比较，阳性对照组以及王枣子叶总黄酮各剂量组不同时间段的血糖值均降低(P<0.05)，表明王枣子叶总黄酮能控制小鼠血糖水平的升高，改善糖耐量异常，其中低剂量组效果较好。

3.4 王枣子叶总黄酮对小鼠脂代谢的影响 如图4所示，与正常组比较，模型组小鼠血清TC、TG水平升高(P<0.01)，HDL-C水平降低(P<0.01)；与模型组比较，阳性对照组以及王枣子叶总黄酮各剂量组小鼠血清TC、TG水平降低(P<0.05)，HDL-C水平升高(P<0.05)，表明王枣子叶总黄酮能有效地改善糖尿病小鼠脂代谢紊乱，其中低剂量组效果较好。

4 讨论

α-葡萄糖苷酶抑制剂(阿卡波糖、伏格列波糖等)是一类新型的口服降血糖药物，可有效抑制小肠体内的α-葡萄糖苷酶活性，目前已广泛应用于2型糖尿病及并发症的防治。α-葡萄糖苷酶能够水解低聚糖α-1,4糖苷键，生成可以直接被人体吸收的葡萄糖。通过抑制α-葡萄糖苷酶活性可使单糖消化吸收过程受阻，缓解餐后血糖升高的症状[10,20]。2型糖尿病的显著特征之一是血糖水平升高，控制血糖升高是减少和减轻糖尿病及其并发症的重要方法。研究证实，糖耐量异常是2型糖尿病发生发展过程中常见的现象，糖耐量实验是机体血糖调节机能的一种检查方法。脂代谢异常是2型糖尿病及其并发症的原发性病理、生理过程，患者通常伴有脂代谢异常，且能进一步演变成严重的心血管疾病[2]。

本研究通过α-葡萄糖苷酶活性抑制实验及四氧嘧啶糖尿病小鼠模型，探讨王枣子叶总黄酮体内外降糖活性。研究表明，王枣子叶总黄酮对α-葡萄糖苷酶具有较强的抑制活性，且呈量效关系；王枣子叶总黄酮各剂量组均能降低糖尿病小鼠血糖和血清TC、TG水平，升高HDL-C水平，改善葡萄糖糖耐量的异常及糖尿病引起脂代谢紊乱情况，其中低剂量组效果最好，接近二甲双胍阳性对照组。但有关王枣子叶总黄酮的降糖机理还需进一步探讨。