三七总皂苷对糖尿病肾病大鼠肾纤维化的改善作用

李 娜， 王风云， 郑 雁， 肖亚利， 苌沛森， 马素好， 侯小丽， 姬新颖

(1.郑州澍青医学高等专科学校基础医学部，河南 郑州 450064；2.河南应用技术职业学院护理学院，河南 郑州 450000；3.河南大学医学院，河南 开封 475000)

随着人们寿命的延长和饮食结构的改变，糖尿病肾病成为我国终末期肾疾病的重要病因，严重影响人类的健康[1]。肾纤维化是糖尿病肾病的主要病理改变，其纤维化程度与肾功能损伤息息相关，但目前临床上尚无治疗肾纤维化的特效药物[2]。

鞘氨醇激酶1(SphK1)由Obinata等首次从大鼠肾组织纯化提取出来，可催化鞘氨醇(Sp)生成1-磷酸鞘氨醇(S1P)[3]。临床上发现，糖尿病肾病患者肾组织SphK1活性增强，S1P水平增加[4]。兰天等[5]研究发现，糖尿病大鼠肾脏SphK1-S1P信号通路被激活，促使肾功能损伤。相关研究发现，在高糖、糖基化终末产物(AGEs)和氧化应激等状态下，SphK1被激活，S1P水平增加使肾小球系膜细胞(MC)增殖和迁移，进而分泌大量的炎性介质和细胞外基质成分，加速肾纤维化进展[6-10]。氧化应激是高糖介导组织损伤途径的主要原因，也是肾纤维化形成的关键因素，贯穿于肾纤维化发生、发展的始终，在糖尿病肾纤维化的发病机制中发挥着重要作用[11-12]。因此，药物是否通过氧化应激途径激活SphK1-S1P信号通路，从而促进肾组织的炎症及纤维化的进程尚不明确。

传统医学认为，糖尿病肾病患者多以肾病血瘀证为主要症候，常伴有血尿，若单纯用止血药进行治疗，可止血但不可化瘀，若单纯用活血药物进行治疗，可化瘀但不可止血[13]。三七因具有活血和止血的双重功效，已成为临床上治疗肾病血瘀证患者的首选药物[14]。三七总皂苷是中药三七的主要活性成分，具有抗氧化、改善微循环、抗炎、抗休克等药理活性[15-16]。现代药理研究显示，三七总皂苷可改善糖尿病肾病模型大鼠的肾功能，延缓肾纤维化，但其具体作用机制尚不明确[17]。本研究基于SphK1-S1P信号通路，通过建立糖尿病肾病模型，探讨三七总皂苷改善糖尿病肾病肾纤维化的作用机制，以期为寻找相关药物提供新方向。

1 材料

1.1 仪器 BLT GelView 6000 Pro型化学发光成像系统(广州博鹭腾生物科技有限公司)；稳捷血糖仪(美国强生公司)；7600型全自动生物化学分析仪(日本日立公司)；实时荧光定量聚合酶链式反应(PCR)仪(美国Thermo Fisher Scientific公司)；PowerPac型电泳仪(美国Bio-Rad公司)；RM2125 RTS型手动轮转式切片机(德国Leica公司)；BX61型光学显微镜(日本Olympus公司)；M200 PRO型多功能酶标仪(瑞士Tecan公司)。

1.2 试剂与药物 三七总皂苷(纯度99%，含量80%，批号TB20171210)购自西安天宝生物科技有限公司。链脲佐菌素(STZ，批号SO1300)购自美国Sigma公司；尿微量白蛋白(mAlb)酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒(批号20170102B)购自中国原子能科学研究所；丙二醛(MDA，批号20171017)、还原型谷胱甘肽(GSH，批号20170815)、总超氧化物歧化酶(T-SOD，批号20170720)、血清胱抑素(Cys-C，批号20180714)、Masson染色试剂盒(批号20180521)均购自南京建成生物工程研究所；PCR引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，引物序列及产物长度见表1；Prime ScriptTMRT reagent kit(批号DRR041)、SYBR Premix Ex TaqTMⅡ(批号RR820A)购自日本TaKaRa公司；S1P、C17-S1P对照品(纯度大于97%)购自美国Avanti Polar Lipids公司。其余试剂均为分析纯；水为超纯水。

表1 PCR引物序列

1.3 动物 SPF级SD大鼠，雄性，10～16周龄，体质量200～220 g，购自河南省实验动物中心，实验动物使用许可证号SYXK(豫)2019-0002。大鼠饲养条件为温度(23±1)℃，相对湿度(54±10)%，12 h/12 h明暗交替，自由进食饮水。

2 方法

2.1 分组、造模与给药 参照文献[18]报道，大鼠适应性喂养1周后禁食12 h，分为正常组(12只)和造模组(38只)，造模组腹腔注射STZ溶液(65 mg/kg，临用时以柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液溶解)，正常组大鼠腹腔注射等体积柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液，72 h后尾静脉采血，禁食8 h后检测空腹血糖(FBG)水平，连续4 d FBG均不低于16.7 mmol/L，则表明造模成功[19]。剔除造模不成功大鼠2只，将36只造模成功者随机分为模型组和三七总皂苷高、低剂量组(62、31 mg/kg，临用时以生理盐水溶解)，每组12只，其中三七总皂苷组大鼠灌胃给予相应剂量药物，正常组和模型组大鼠灌胃给予等量生理盐水，每天1次，连续8周。

2.2 样品采集 末次给药后，大鼠转入代谢笼中，收集24 h尿液，腹腔注射5%水合氯醛(6 mL/kg)进行麻醉，腹主动脉取血2 mL(空腹时间大于8 h)，2 000 r/min离心2 min，分离得血清，用于检测生化指标。取血后，大鼠脱颈椎处死，取肾组织，分离肾皮质，一部分置于4%多聚甲醛溶液中固定，用于组织病理学观察；另一部分用于肾组织氧化应激指标和相关蛋白表达的检测。

2.3 大鼠FBG、体质量检测 造模成功后，各组大鼠每周定期尾静脉采血检测其FBG和体质量。

2.4 大鼠肾组织肥大指数和肾功能相关指标检测 取“2.2”项下大鼠肾组织，称定质量，计算其肾肥大指数。取“2.2”项下大鼠尿液，按照相应试剂盒说明书方法检测mAlb水平。取“2.2”项下大鼠血清，采用全自动生化分析仪检测血清BUN、Scr、Cys-C水平。

2.5 大鼠肾组织AGEs水平及氧化应激相关指标检测 取“2.2”项下大鼠肾组织，加生理盐水进行组织匀浆，按照相应试剂盒说明书方法检测AGEs、MDA、GSH水平及T-SOD活性。

2.6 大鼠肾组织病理学形态观察 随机取“2.2”项下4%多聚甲醛溶液固定的大鼠肾组织，每组8份，经水洗、乙醇脱水后石蜡包埋，切成4 μm薄片，随机抽取一部分进行HE染色，另一部分进行Masson染色，在光学显微镜下观察，选取400倍镜下20个互不重叠的视野，采用Image-pro Plus 6.0软件进行Masson染色半定量分析，计算肾胶原蓝染面积。

2.7 RT-qPCR法检测大鼠肾组织SphK1、FNmRNA表达 取“2.2”项下大鼠肾组织，每组5份，采用TRIzol法抽提总RNA，经过逆转录反应合成cDNA，以cDNA为模板进行PCR扩增。反应体系(20 μL)为SYBR Green Mix 10 μL，正向、反向引物各0.7 μL，ddH2O 7.6 μL，cDNA模板1.0 μL。反应条件为98 ℃预变性3 min；98 ℃变性10 s，60 ℃退火10 s，72 ℃延伸30 s，循环30次；72 ℃延伸5 min。以β-actin为内参，采用2-ΔΔCT法计算目的基因mRNA相对表达，重复3次。

2.8 大鼠肾组织SphK1酶活性及S1P水平检测 随机取“2.2”项下大鼠肾组织适量，每组5份，加入裂解液裂解提取蛋白，4 ℃、14 000 r/min离心20 min，取上清液，采用BCA蛋白定量试剂盒检测蛋白浓度，参考文献[20]报道方法检测SphK1酶活性，以正常组为参照，计算其余各组相对酶活性。另随机取“2.2”项下大鼠肾组织适量，每组5份，生理盐水制备组织匀浆，采用BCA蛋白定量试剂盒检测蛋白浓度，取15 μL组织匀浆液，加入10 μL C17-S1P(内标，10 μg/L)混匀，再加入75 μL甲醇，涡旋后12 000 r/min离心5 min，取10 μL上清液，采用LC-MS/MS法检测肾组织S1P水平[21]，并以正常组为参照，计算大鼠肾组织S1P相对水平。

3 结果

3.1 三七总皂苷对大鼠FBG、体质量的影响 与正常组比较，模型组大鼠第2～8周FBG水平均升高(P<0.05)，第4～8周体质量均降低(P<0.05)；与模型组比较，三七总皂苷各剂量组大鼠第2～8周FBG水平降低(P<0.05)，第4～8周体质量升高(P<0.05，P<0.01)，见表2。

表2 各组大鼠FBG、体质量比较

3.2 三七总皂苷对大鼠肾肥大指数及肾功能相关指标的影响 与正常组比较，模型组大鼠肾肥大指数及mAlb、BUN、Scr、Cys-C水平均升高(P<0.01)；与模型组比较，三七总皂苷各剂量组肾肥大指数及mAlb、BUN、Scr、Cys-C水平均降低(P<0.05，P<0.01)，见表3。

表3 各组大鼠肾肥大指数、肾功能相关指标比较

3.3 三七总皂苷对大鼠肾组织AGEs水平及氧化应激相关指标的影响 与正常组比较，模型组大鼠肾组织AGEs、MDA水平均升高(P<0.01)，T-SOD活性及GSH水平均降低(P<0.01)；与模型组比较，三七总皂苷各剂量组大鼠肾组织AGEs、MDA水平降低(P<0.05)，T-SOD活性及GSH水平升高(P<0.05)，见表4。

表4 各组大鼠肾组织AGEs水平、氧化应激相关指标比较

3.4 三七总皂苷对大鼠肾组织病理形态的影响 肉眼观察发现，正常组大鼠双肾颜色红润，大小正常，包膜完整；模型组大鼠双肾体积增大，颜色暗红，皮质较厚。HE染色显示，正常组大鼠肾皮质、髓质分界清晰，肾小球、肾小管排列紧密，无明显炎症细胞浸润，系膜细胞无增生，肾间质未见增生及胶原纤维组织沉积；模型组大鼠肾小球体积增大，肾小管上皮细胞空泡变性，间质增生水肿，有大量炎性细胞浸润，肾小球周边伴有大量纤维化组织沉积；三七总皂苷各剂量组大鼠肾组织的炎细胞浸润、纤维化沉积明显改善。Masson染色结果显示，与正常组比较，模型组大鼠胶原蓝染面积增加(P<0.05)；与模型组比较，三七总皂苷各剂量组大鼠胶原蓝染面积减少(P<0.05)，见图1、表5。

表5 各组大鼠胶原蓝染面积比较

3.5 三七总皂苷对大鼠肾组织SphK1、FNmRNA表达的影响 与正常组比较，模型组大鼠肾组织SphK1、FNmRNA表达均升高(P<0.01)；与模型组比较，三七总皂苷各剂量组大鼠肾组织SphK1、FNmRNA表达降低(P<0.05，P<0.01)，见图2～3。

3.6 三七总皂苷对大鼠肾组织SphK1酶活性及S1P水平的影响 与正常组比较，模型组大鼠肾组织SphK1酶活性、S1P水平均升高(P<0.01)；与模型组比较，三七总皂苷各剂量大鼠肾组织SphK1酶活性、S1P水平均降低(P<0.05，P<0.01)，见表6。

表6 各组大鼠肾组织SphK1酶活性、S1P水平比较

4 讨论

本研究通过单次腹腔注射STZ(65 mg/kg)复制大鼠糖尿病肾病模型，造模后大鼠的FBG不低于16.7 mmol/L，且肾小球体积增大，肾小管上皮细胞空泡变性，间质增生、水肿，大量炎性细胞浸润，肾小球周边伴有大量纤维化组织沉积。经三七总皂苷干预后，大鼠FBG、肾脏肥大指数、尿液中mAlb和血清中Scr、BUN、Cys-C水平均降低，肾组织炎性细胞浸润与纤维化沉积明显改善，表明三七总皂苷能改善糖尿病肾病模型大鼠的肾功能，与相关研究报道一致[22]。由于目前临床上无治疗肾纤维化的特效药，故在本研究中未设置阳性对照组。

糖尿病肾病发病机制复杂，其中高血糖是引起糖尿病肾病的重要始动因素，晚期糖基化终产物AGEs的蓄积可激活体内活性氧簇(ROS)水平，从而导致肾组织脂质过氧化和炎症反应，刺激促纤维化因子产生，进而加快肾纤维化进程[23]。氧化与抗氧化防御机制的失衡是肾间质纤维化发生发展的关键环节。GSH、T-SOD是组织内常见抗氧化剂，其水平/活性多少体现组织抗氧化能力的强弱。MDA是花生四烯酸过氧化分解产物，是氧化应激的主要指标[24]。本研究结果显示，与正常组比较，模型组大鼠肾脏中AGEs、MDA水平均升高，GSH水平及T-SOD活性均降低；经三七总皂苷干预后，大鼠肾脏GSH水平及T-SOD活性均升高，AGEs水平降低，提示三七总皂苷可能通过上调肾组织GSH水平及T-SOD活性，发挥抗氧化作用，从而改善肾损伤。

在高糖、AGEs和氧化应激等状态下，SphK1/S1P信号通路可被激活，从而调节肾纤维化进程[25-26]。Huang等[27]研究发现，在特发性肺纤维化时，抑制Sphk1的活性可使人肺成纤维细胞(HLFs)中FN和α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)水平降低，由此推测，抑制Sphk1活性可改善器官纤维化。本研究结果显示，与正常组比较，模型组大鼠肾组织SphK1、FNmRNA表达及SphK1酶活性、S1P水平均升高；经三七总皂苷干预后，大鼠肾组织SphK1、FNmRNA表达及SphK1酶活性、S1P水平均降低，提示三七总皂苷可通过抑制SphK1/S1P信号通路活性，下调FN表达，进而延缓肾组织的纤维化进程。

综上所述，三七总皂苷可改善糖尿病肾病模型大鼠的肾功能，其作用机制可能与抗氧化、抑制SphK1/S1P通路活性、下调FN表达有关。