斑花黄堇质量标准研究

吴 江， 马如媛， 林鹏程

(1.青海民族大学化工学院，青海 西宁 810007；2.青海省青藏高原植物化学重点实验室，青海 西宁 810007；3.青海民族大学药学院，青海 西宁 810007)

斑花黄堇是具有活血散瘀、利气止痛等功能的罂粟科紫堇属植物。斑花黄堇的药用部位为全草，用于清热解毒、止痛、治热性传染病等[1]，主要分布在甘肃西南部、青海西南部、四川西北及西部地区、西藏东部和中部，适生于海拔4 300～5 300 m青藏高原。因其生境环境恶劣、分布区域狭窄、全草采挖等原因，资源面临濒危。藏药厂和藏医院已用灰绿黄堇等其他紫堇属作为替代药材使用[2]，资源利用杂乱。斑花黄堇藏药材依赖于原产地采挖，尚无规模化种植生产。为提高其用药质量，迫切需要建立斑花黄堇质量标准。鉴于此，对斑花黄堇的性状、基原、显微特征、薄层色谱、水分、灰分、浸出物、有效成分含量等项进行深入研究，为其质量标准的制定与开发利用提供依据。

1 材料

Sartorius BS 224 S电子天平(德国Sartorius公司)；KQ-500DE型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；OLYMPUS BX-51显微成像仪(日本Olympus公司)；卡玛数码薄层成像仪(瑞士卡玛公司)；101-A 电热鼓风干燥箱(上海实验仪器厂有限公司)；Aglient1200型高效液相色谱仪(美国安捷伦有限公司)。

硅胶G板(10 cm×20 cm)(青岛海洋化工有限公司)。碘化铋钾(分析纯)(天津百世化工有限公司)；碘化碘钾(分析纯)(天津百世化工有限公司)；水合氯醛(分析纯)(天津百世化工有限公司)；异紫堇定碱对照品(上海宝曼生物科技有限公司)；甲醇、乙腈、磷酸(天津百世化工有限公司)；其他试剂(分析纯)。

本研究所用药材收集不同产地及来源的斑花黄堇药材共计8批，经过青海民族大学药学院林鹏程教授鉴定为罂粟科植物斑花黄堇CorydalisconspersaMaxim.的草本植物，见表1。

表1 样品信息

2 方法

2.1 药物鉴别

2.1.1 性状鉴别 本品丛生草本。根子红色，根茎短，簇生棒状肉质须根，茎发自基生叶腋，裸露，不分枝。总状花序头状，多花，花淡黄色，具棕色斑点。苞片菱形，棕褐色，具流苏状齿。气味浓。微苦。

2.1.2 基原鉴定 本品丛生草本，高5～30 cm。根茎短，簇生棒状肉质须根，上部具叶和1～4茎。茎发自基生叶腋，基部稍弯曲，裸露，其上具叶，不分枝。基生叶多数，约长达花序基部；叶柄约与叶片等长，基部鞘状宽展；叶片长圆形，二回羽状全裂；一回羽片2～8对，对生或近对生；二回羽片常仅3枚，三深裂，裂片椭圆形或卵圆形，约长3～4 mm，宽2 mm，较密集，常呈覆瓦状叠压。茎生叶多数，与基生叶同形，较小。总状花序头状，长2～4 cm，宽2～2.5 cm，多花、密集；花近俯垂。苞片菱形或匙形，下部的长6～8 mm，宽度常大于长度，边缘紫色，全缘或顶端具啮蚀状齿。花梗粗短，长约5 mm。萼片菱形，棕褐色，具流苏状齿。花淡黄色或黄色，具棕色斑点。上花瓣长1.5～2 cm，具浅鸡冠状突起；距圆筒形，钩状弯曲；蜜腺体约贯穿距长的1/2。下花瓣与上花瓣相似，爪较长。内花瓣具高而伸出顶端的鸡冠状突起；爪细长。约长于瓣片2倍。雄蕊束披针形。柱头近扁四方形，顶端2浅裂，具8乳突。蒴果长圆形至倒卵圆形，约长1 cm，宽4 mm。

2.1.3 显微鉴别 本品粉末为黄棕色或灰绿色。叶表皮细胞表面观呈多角形，垂周壁波状弯曲且连珠状增厚。叶表面气孔不定式。花粉粒类圆形，表面具有网状纹理。纤维大多成束，细长且壁厚。木栓细胞壁厚，表面观呈类多角形。非腺毛单细胞，壁厚。导管主要为梯形导管和螺纹导管。显微特征图见图1～8。

2.1.4 薄层鉴别

2.1.4.1 对照品溶液的制备 取异紫堇定碱对照品，精确称量，加入甲醇制成0.05 mg/mL的溶液，即得。

2.1.4.2 供试品溶液的制备 取斑花黄堇粉末约2.0 g，精确称重，加入具塞锥形瓶中，加入氯仿-甲醇-浓氨水(5∶1∶0.1)25 mL，于20 ℃下超声提取，过滤，蒸发至干，将残留物加至1 mL甲醇中，并在25 mL量瓶中用甲醇稀释至规定体积。

2.1.4.3 鉴别方法 对照品溶液和供试品溶液各5 μL，将对照品溶液与供试品溶液点于同一硅胶G薄层板上，展开剂为甲苯-乙酸乙酯-甲醇-异丙醇-氨水(7∶2.5∶3∶1.5∶0.5)的下层溶液，进行展开，取出，晾干，喷3% AlCl3乙醇溶液显色，在110 ℃的热板上烘烤5 min，在365 nm紫外线灯下观察。斑花黄堇色谱图和对照品溶液的色谱图中的斑点位于相应的位置呈现相同的颜色，见图9。

2.2 药物检查 对药材的常规检查可以有效地评价药材的优劣，对斑花黄堇的水分、总灰分和酸不溶性灰分及浸出物进行了检查[3-4]，旨在建立斑花黄堇的水分检查、灰分检查、浸出物检查的标准限度，可在一定程度上反应药材质量。5批斑花黄堇的水分为7.38%～10.30%；总灰分为9.33%～16.20%；酸不溶性灰分为0.67%～3.34%。醇溶性浸出物为5.73%～8.64%；水溶性浸出液为17.73%～ 27.39%。见表2。

表2 测定结果

2.3 含量测定

2.3.1 色谱条件 Hypersi BDS C18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流动相乙腈(A)-0.2%磷酸(B)(0～45 min，5%～65%A)，梯度洗脱；体积流量1.0 mL/min；柱温30 ℃；检测波长225 nm；进样体积10 μL。理论板数按异紫堇定碱峰计算应不低于5 000。色谱图见图10～11。

2.3.3 方法学考察

2.3.3.1 线性关系考察 准确吸取1、2、4、6、8、16 μL异紫堇定碱对照品溶液，在“2.3.1”项下的色谱条件下进样测定，以对照品质量浓度为横坐标(X)，峰面积为纵坐标(Y)进行回归，得到回归方程为Y= 91.363X-19.846，r=0.999 6。异紫堇定碱在0.05～0.8 μg的范围内线性关系良好。

2.3.3.2 精密度试验 精密吸取对照品溶液6份，连续进样6次，记录峰面积，测得峰面积RSD为0.41%，表明仪器的精密度良好。

2.3.3.3 稳定性试验 取同一份供试品溶液，分批次在室温下0、4、8、12、24 h进样测定，测得异紫堇定碱RSD为0.81%。结果表明供试品溶液在室温下24 h内稳定。

2.3.3.4 重复性试验 取6个样品，约2 g，在“2.1.4.2”项下方法制备，在“2.3.1”项下的色谱条件下进样测定。测得斑花黄堇中异紫堇定碱的含量为0.007%，RSD为0.93%。结果表明方法重复性良好。

2.3.3.5 加样回收率试验 准确称量6个样品(约2.0 g)，加入0.05 mg的对照品溶液，在“2.1.4.2”项下方法制备，在“2.3.1”项下的色谱条件下进样测定，记录峰面积。斑花黄堇中异紫堇定碱的平均加样回收率为96.40%，RSD为1.13%。

2.3.3.1 样品含量测定 将收集到的8批斑花黄堇药材，分批次在“2.1.4.2”项下方法制备供试品溶液，在“2.3.1”项下的色谱条件下进样测定，计算斑花黄堇中异紫堇定碱含量，见表3。样品中的异紫堇定碱含量为0.001%～0.018%。

表3 含量测定结果

3 讨论

本研究通过性状特征可有效区别不同来源及易混淆品种的紫堇属藏药，其薄层图谱斑点清晰可见，分离度好，能够有效鉴别药材真伪。对水分、灰分、浸出物等项进行测定，初步确定各限量标准，斑花黄堇的水分含量应低于9.0%，总灰分含量应低于15.0%，酸不溶性灰分含量应低于2.0%，醇溶性浸出物含量应高于5.0%，水溶性浸出物含量应高于17.0%。利用HPLC法测定异紫堇定碱的含量，各产地斑花黄堇含量差异大。其化学成分因受海拔、土壤、温度、光照、水分、坡度等多种生态因子的影响[5-11]。

综上所述，本研究方法可作为斑花黄堇质量标准制定的参考，为其人工种植及开发利用提供质量保证。