左旋延胡索乙素对快速眼动睡眠剥夺大鼠学习记忆和睡眠活动节律的影响

王艳艳， 卞宏生， 李海妮， 陈芋霏， 李玟玟， 李廷利， 黄莉莉

(黑龙江中医药大学，黑龙江 哈尔滨 150040)

现代社会越来越多的人受到睡眠障碍的困扰，经历着不同程度的睡眠剥夺[1]。据调查，在我国30～79岁人群中，患有睡眠障碍的高达23.1%[2]。睡眠障碍会影响重要的大脑功能，如警觉性、认知功能，亦可增加负面情绪[3-5]。有研究表明，快速眼动睡眠剥夺可影响记忆的巩固，导致海马依赖性学习和记忆障碍等[6-7]。睡眠具有昼夜节律，与饮食、情绪、代谢、认知、行为等多项生理指标有关联，对于维持机体稳态和生理活动的正常具有重要意义[8]。

延胡索为罂粟科植物延胡索CorydalisyanhusuoW.T.Wang的干燥块茎，具有活血化瘀、行气止痛等功效，李时珍记载延胡索“专治一身上下诸痛，用之中的，妙不可言”。延胡索镇痛的主要活性物质为生物碱，其中以延胡索乙素作用最强[9-10]，镇痛效果被称为中药中的吗啡[11]。现代研究发现，延胡索乙素除具有镇痛镇静作用外，还有抗心律失常、改善血脂、保护缺血再灌注组织等作用[12-13]，并且该成分为消旋体，其左旋体活性较强，但它是否干预快速眼动睡眠剥夺所致的认知障碍和睡眠活动觉醒节律尚不清楚。因此，本研究通过六角迷宫实验和动物监测系统，考察左旋延胡索乙素对快速眼动睡眠剥夺大鼠学习记忆功能、睡眠觉醒节律和能量代谢的影响。

1 材料

1.1 动物 SPF级SD大鼠，雄性，体质量(240±20)g，由黑龙江中医药大学GLP实验室提供，实验动物生产许可证号SCXK(黑) 2018-007。饲养环境为温度(22±2)℃，相对湿度(55±15)%，12 h/12 h明暗交替。经黑龙江中医药大学实验动物管理和使用委员会审核，实验动物伦理审查批准编号DWLL20191228001。

1.2 试剂与药物 左旋延胡索乙素(纯度≥98%，上海融禾医药科技发展有限公司，批号170926)；地西泮片(山东信谊制药有限公司，批号191006)。氯化钠注射液(哈尔滨三联药业股份有限公司，批号200907D06)；2% DMSO(上海阿拉丁生化科技股份有限公司，批号D103273)；γ-氨基丁酸(GABA)酶联免疫检测试剂盒(货号H168-1-2)、谷氨酸测试盒(货号A074-1-1)均购自南京建成生物工程研究所。

1.3 仪器 睡眠剥夺箱(自制)；六角迷宫箱(俄罗斯阿穆尔国立医学院)；实验动物监测系统(型号CLAMS，美国Columbus公司)；动物行为学采集与分析系统(型号BL420F，成都泰盟软件有限公司)。

2 方法

2.1 动物分组及给药 32只大鼠随机分为空白组、模型组、阳性药组及左旋延胡索乙素高、低剂量组，每组8只。左旋延胡索乙素各组分别灌胃给予15、5 mg/kg左旋延胡索乙素溶液，空白组和模型组灌胃给予等体积生理盐水，阳性药组给予1 mg/kg地西泮溶液，每天19：00给药1次，连续7 d。

2.2 建立睡眠剥夺模型 采用多平台水环境法建立大鼠睡眠剥夺模型。给予药物或生理盐水5 d后，将动物放入睡眠剥夺箱(90 cm×70 cm×50 cm，内有12个平台，高8.0 cm，直径6.3 cm，平台之间间隔15 cm，平台周边注满水，水面距平台面约1.0 cm，水温保持在25 ℃左右)内进行快速眼动睡眠剥夺，共24 h。

2.3 六角迷宫实验 六角迷宫箱，由俄罗斯阿穆尔国立医学院格里格力耶夫教授发明，箱体为六角形，周壁带有6个可关闭的门，底面铺有可通电的铜栅。训练时，以铃声为刺激，足底电击为非条件刺激。实验通过摄像系统及计算机记录大鼠的寻找时间、寻找频率和认知率，综合以上指标，可考察动物的探究积极性、兴奋性、认知能力[14]。本实验各组动物于给药后第3天开始学习记忆训练，训练时间为3 d，于第5天进行24 h的快速眼动睡眠剥夺，剥夺后的动物休息24 h后，于给药第7天放入六角迷宫箱中进行学习记忆的测试，并记录各指标。

2.4 能量代谢、自主活动、睡眠时间和睡眠活动节律检测 分别将睡眠剥夺后的各组大鼠置于实验动物监测系统的代谢笼内，在定时光照(照明时间为7：00～19：00，熄灯时间为19：00～次日7：00)的条件下，采用CLAMS系统对大鼠进行24 h的监测，该系统还持续监测大鼠的进食活动[15]。通过撞击红外光束，判断大鼠活动次数[12](在系统监测前设置参数，采集率为1 samples/60 s，即系统每1 min自动收集1次样本数据，每天有1 440个采集点)，以活动次数为0作为依据，计算大鼠24 h的睡眠时间，由于19:00～20:00为灌胃给药时间，自主活动和睡眠时间影响较大，故此时间段数据不作处理，实验结果计算总时间为23 h(20:00～次日19:00)。

2.5 神经递质水平检测 行为学实验完成后，大鼠腹腔注射10%水合氯醛(0.4 mL/100 g)进行麻醉，颈总动脉取血，3 000 r/min离心20 min，取上清液。按试剂盒说明书操作方法进行检测，并计算大鼠血清中Glu和GABA水平。

3 结果

3.1 左旋延胡索乙素对睡眠剥夺大鼠学习记忆的影响 如表1所示，与空白组比较，模型组大鼠寻找时间、错误次数增加(P<0.05)，认知率降低；与模型组比较，左旋延胡索乙素高剂量组大鼠认知率提高，寻找时间和错误次数减少 (P<0.01)。

表1 左旋延胡索乙素对睡眠剥夺大鼠学习记忆的影响

3.2 左旋延胡索乙素对睡眠剥夺大鼠自主活动的影响 如表2所示，与空白组比较，模型组大鼠白天、夜晚及全天平均活动次数均减少(P<0.01)；与模型组比较，阳性药组和左旋延胡索乙素各剂量组大鼠白天、夜晚及全天活动次数均减少(P<0.01)。

表2 左旋延胡索乙素对睡眠剥夺大鼠自主活动的影响

3.3 左旋延胡索乙素对睡眠剥夺大鼠睡眠时间的影响 如表3所示，与空白组比较，模型组大鼠白天、夜晚及全天睡眠时间均增加，但无统计学差异(P>0.05)；与模型组比较，阳性药组大鼠白天、夜晚及全天睡眠时间均增加，其中夜晚睡眠时间具有统计学差异(P<0.05)，左旋延胡索乙素高剂量组夜晚及全天睡眠时间增加，但无统计学差异(P>0.05)，左旋延胡索乙素低剂量组夜晚和全天睡眠时间均增加(P<0.05，P<0.01)。

表3 左旋延胡索乙素对睡眠剥夺大鼠睡眠时间的影响

3.4 左旋延胡索乙素对睡眠剥夺大鼠睡眠活动节律的影响 通过降噪处理，对各组大鼠给药后每小时的睡眠时间进行分析，结果如图1所示，与空白组比较，模型大鼠在21～22时、2～3时、5～6时、15～18时睡眠时间增加(P<0.05，P<0.01)；与模型组比较，阳性药组在22～24时、6～7时、7～8时、13～15时睡眠时间增加(P<0.05，P<0.01)，左旋延胡索乙素高剂量组在20～21时、23～24时睡眠时间增加(P<0.05，P<0.01)，16～18时睡眠时间减少(P<0.05)，左旋延胡索乙素低剂量组在22～1时、11～15时睡眠时间增加(P<0.05，P<0.01)。

3.5 左旋延胡索乙素对睡眠剥夺大鼠睡眠活动节律的影响 如图2所示，与阳性药地西泮比较，左旋延胡索乙素作用特点为给药后睡眠发生次数增加，睡眠时间延长，药效发挥迅速，但其药效维持时间相对较短，其中高剂量给药12 h后大鼠活动力恢复。

3.6 左旋延胡索乙素对睡眠剥夺大鼠神经递质水平的影响 如表4所示，与空白组比较，模型组大鼠海马中Glu和GABA水平升高(P<0.01)；与模型组比较，阳性药组和左旋延胡索乙素高剂量组大鼠海马中Glu和GABA水平均降低(P<0.05，P<0.01)。

表4 左旋延胡索乙素对睡眠剥夺大鼠神经递质水平的影响

3.7 左旋延胡索乙素对睡眠剥夺大鼠能量代谢的影响 如表5所示，与空白组比较，模型组大鼠白天产热量、摄食量和饮水量均增加，夜晚产热量和饮水量则减少；与模型组比较，阳性药组和左旋延胡索乙素各剂量组大鼠白天摄食量减少(P<0.01)。

表5 左旋延胡索乙素对睡眠剥夺大鼠能量代谢的影响

3.8 大鼠睡眠时间与能量代谢的相关性分析 如表6所示，大鼠白天睡眠时间与产热量呈负相关(P<0.01)，夜晚睡眠时间与白天产热量和摄食量均呈负相关(P<0.01)，上述结果提示能量代谢指标如产热量、饮水量等与睡眠时间具有一定相关性。

表6 大鼠睡眠时间与能量代谢的相关分析

4 讨论

有研究显示，正常睡眠能够促进记忆的巩固，而睡眠障碍则会导致认知能力下降[16]。王纯等[1]发现慢性睡眠剥夺可加重9月龄3xTg-AD小鼠的识别记忆能力、工作记忆和条件恐惧记忆能力损伤。另有报道称左旋延胡索乙素能抑制冰毒诱导的小鼠空间记忆损伤[17]。本实验结果显示，快速眼动睡眠剥夺后，模型组大鼠寻找时间延长，寻找频率和认知率降低，表明睡眠剥夺后大鼠出现学习记忆障碍。左旋延胡索乙素干预后，高剂量组大鼠认知率提高，错误次数减少，提示该成分可改善快速眼动睡眠剥夺后大鼠的学习记忆能力。

徐波等[18]采用对氯苯丙氨酸腹腔注射叠加多平台水环境剥夺可造成大鼠睡眠节律紊乱，并考察了安寐丹对不同周期睡眠剥夺模型大鼠昼夜节律、学习记忆及食欲素的影响。本实验结果显示，快速眼动睡眠剥夺大鼠的睡眠时间增加，自主活动次数减少，但睡眠活动节律未改变，提示睡眠剥夺24 h未改变大鼠的昼夜节律。给药后，阳性药地西泮组大鼠各时间段睡眠时间均有延长，活动力降低，且维持时间长。镇静催眠药物如地西泮等具有中枢神经系统抑制作用，其副反应为易产生依赖性、戒断症状和宿醉反应。宿醉反应作为化学类助眠药物的常见后遗效应，表现为服药次晨出现头晕、嗜睡、精细运动不协调等[19]。与阳性药地西泮组比较，左旋延胡索乙素作用特点为给药后睡眠剥夺大鼠睡眠发生次数增加，睡眠时间延长，且药效发挥迅速，但维持时间相对较短，大鼠活动力恢复较快，无宿醉现象，且未呈现剂量依赖性。本实验在夜晚给药时，发现大鼠夜晚睡眠时间延长，前期研究发现，当白天给药时，左旋延胡索乙素可增加大鼠的白天睡眠时间。因此，推测延胡索可能具有调节睡眠剥夺大鼠睡眠活动节律的作用。

清醒状态下测得的代谢率为静息代谢率，估算了在日常生活中大多数清醒状态下的最低能耗。睡眠时测得的代谢率为睡眠代谢率，因为睡眠时测得的能耗值明显减少了意识活动带来的额外能耗部分，测得的结果具有更高重复性和精确性[20-21]。本实验进行了快速眼动大鼠睡眠时间与能量代谢相关指标的相关分析。结果显示，大鼠白天和夜晚睡眠时间与白天产热量呈负相关，提示睡眠时间延长，产热量减少，大鼠在睡眠状态下意识活动减少时能耗降低。

综上所述，左旋延胡索乙素可提高快速眼动睡眠剥夺组大鼠的认知能力，减少自主活动，延长睡眠时间，且无宿醉现象，是一个极具潜力的催眠剂。然而该成分作为镇静催眠药物的临床应用频率较低，近年来实验研究和临床数据均较少，故本研究可为其广泛应用提供理论依据。