基于标准汤剂的槲寄生配方颗粒质量标准研究

张智远， 丁 洁， 曹桂云， 李媛媛， 耿绍轩， 孟兆青*， 刘玉红,3*

(1.山东中医药大学药学院，山东 济南 250355；2.山东宏济堂制药集团股份有限公司，山东 济南 250103；3.山东省高校中药质量控制与全产业链建设协同创新中心，山东 济南 250355)

槲寄生为桑寄生科植物槲寄生Viscumcoloratum(Komar.)Nakai的干燥带叶茎枝[1-2]，具有抗肿瘤、抗氧化、抗骨质疏松等药理作用，而且不良反应少，来源广泛，开发价值高[3-5]。

中药配方颗粒以炮制规范的单味中药材为原材料，充分运用现代工艺进行制备，既能保证与传统汤剂一样随证加减，还可规避后者携带不便、煎煮麻烦等缺点，在一定程度上推动了剂型改革创新的进程，但市售品质量良莠不齐，故加强其质量控制非常重要[6]。国家药典委员会于2016年发布《中药配方颗粒质量控制与标准制定技术要求(征求意见稿)》，指出中药配方颗粒应以标准汤剂为与临床汤剂疗效基本一致的标准参照物，并明确以出膏率、指标成分的含量及转移率、特征图谱等指标为表征，从而进一步衡量两者一致性[7-10]。因此，本实验基于标准汤剂对槲寄生配方颗粒质量标准进行研究，以期为探讨其代替传统汤剂的可行性和质量控制提供参考。

1 材料

1.1 仪器 Agilent 1290超高效液相色谱仪、Agilent 1200高效液相色谱仪(美国Agilent Technologies公司)；Waters e2695高效液相色谱仪(美国Waters公司)；TS8606冻干机(德国Fevik公司)；KQ-250DE型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；CP225D电子天平[赛多利斯科学仪器(北京)有限公司]。

1.2 试剂与药物 紫丁香苷对照品(批号111574-201605，中国食品药品检定研究院，纯度95.2%)。槲寄生配方颗粒(每1 g相当于3.5 g药材，批号210601、210602、210603，由药材S5标准汤剂制备，山东宏济堂制药集团股份有限公司)。15批药材具体信息见表1，经山东中医药大学徐凌川教授鉴定为桑寄生科植物槲寄生Viscumcoloratum(Komar.)Nakai的干燥带叶茎枝，根据《中药配方颗粒质量控制与标准制定技术要求》(征求意见稿)要求结合现代临床用药习惯制备标准汤剂，方法为取各批药材100 g，煎煮2次，第1次加10倍量水浸泡30 min，武火煮沸后改为文火煎煮1 h；第2次加8倍量水，武火煮沸后改为文火煎煮40 min，趁热过滤，合并2次滤液，即得，再经浓缩、冷冻干燥制成冻干粉。甲醇为色谱纯(国药集团化学试剂有限公司)；磷酸为色谱纯(美国Fisher Scientific公司)；甲醇为分析纯(天津市富宇精细化工有限公司)；水(杭州娃哈哈集团有限公司)。

表1 样品信息

2 方法与结果

2.1 紫丁香苷含量测定

2.1.1 溶液制备

2.1.1.1 对照品溶液 精密称取紫丁香苷对照品适量，甲醇制成25 μg/mL溶液，即得。

2.1.1.2 供试品溶液 取配方颗粒、标准汤剂冻干粉适量，研细，取粉末约0.3 g，精密称定，置于具塞锥形瓶中，精密加入25 mL70%甲醇，称定质量，超声处理30 min，放冷，70%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得配方颗粒、标准汤剂供试品溶液；取药材约1 g，精密称定，置于具塞锥形瓶中，精密加入25 mL 50%甲醇，称定质量，超声处理30 min，冷却，50%甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，即得药材供试品溶液。

2.1.2 色谱条件与系统适用性试验 Waters Atlantis T3色谱柱，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(100 mm×2.1 mm，1.8 μm)；流动相甲醇-0.1%磷酸(12∶88，40 min)；体积流量0.3 mL/min；柱温30 ℃；检测波长264 nm。精密吸取对照品、供试品溶液各1 μL，在上述色谱条件下进样测定，结果见图1，理论塔板数按紫丁香苷峰计，应不低于5 000。

2.1.3 线性关系考察 精密称取紫丁香苷对照品10.97 mg，甲醇定容至200 mL，依次稀释2、4、8、16倍，在“2.1.2”项色谱条件下进样测定。以对照品质量浓度为横坐标(X)，峰面积为纵坐标(Y)进行回归，得方程为Y=6.148 1X-0.052 7(r=1.000 0)，在3.26～52.20 μg/mL范围内线性关系良好。

2.1.4 方法学考察

2.1.4.1 重复性试验 取配方颗粒6份，按“2.1.1”项下方法制备供试品溶液，在“2.1.2”项色谱条件下进样测定，测得紫丁香苷峰面积RSD为1.06%，表明该方法重复性良好；

2.1.4.2 中间精密度试验 不同分析人员在不同时间点进行试验，测得紫丁香苷含量RSD为1.05%，同时不同仪器测得配方颗粒中该成分含量RSD为1.03%，表明仪器精密度良好。

2.1.4.3 稳定性试验 取同一份供试品溶液，于0、2、4、6、8、12、24 h在“2.1.1”项色谱条件下进样测定，测得紫丁香苷峰面积RSD为1.35%，表明溶液在24 h内稳定性良好。

2.1.4.4 加样回收率试验 取6份配方颗粒粉末，每份约0.15 g，精密称定，加入对照品溶液适量，按“2.1.1”项下方法制备供试品溶液，在“2.1.2”项色谱条件下进样测定，计算回收率。结果，紫丁香苷平均加样回收率为96.69%，RSD为3.75%。

2.1.4.5 耐用性试验 采用不同品牌型号的色谱柱测定同一份供试品溶液，测得紫丁香苷含量RSD为1.73%，表明该方法耐用性良好。

2.1.5 结果分析 取15批药材、标准汤剂、配方颗粒，按“2.1.1”项下方法制备供试品溶液，在“2.1.2”项色谱条件下进样测定，计算出膏率、含量、转移率，结果见表2，可知标准汤剂出膏率、转移率较稳定，而含量具有一定离散性，主要是由于药材差异所致。由表2可知，出膏率平均值为22.18%，22.18%±30%为15.52%～28.83%。因此，采用含量最大值、最小值制定紫丁香苷含量限度，公式为含量上限=配方颗粒制成量×出膏率上限×最大指标含量，即3.5×28.83%×2.73 mg/g=2.75 mg/g；含量下限=配方颗粒制成量×出膏率下限×最小指标含量，即3.5×15.52%×1.15 mg/g=0.62 mg/g，考虑到不同批次药材的差异性及大生产的复杂性，最终确定为0.6～3.0 mg/g。

表2 各样品出膏率、含量、转移率测定结果

另外，3批配方颗粒中紫丁香苷含量符合相关要求；转移率与标准汤剂(S5)接近，而且均在各标准汤剂变异可接受范围内，表明该制剂制备工艺较合理。

2.2 标准汤剂HPLC特征图谱建立

2.2.1 色谱条件与系统适用性试验 Waters Atlantis T3色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相0.1%磷酸(A)-甲醇(B)，梯度洗脱(0～5 min，1%～2%B；5～41 min，2%～41%B)；体积流量1.0 mL/min；柱温30 ℃；检测波长264 nm；进样量3 μL。以紫丁香苷峰为参照峰(S)，理论塔板数应不低于5 000，色谱图见图2。

2.2.2 方法学考察

2.2.2.1 精密度试验 取“2.1.1”项下同一份供试品溶液，在“2.2.1”项色谱条件下进样测定6次，测得各共有峰峰面积RSD为0.54%～0.92%，表明仪器精密度良好。

2.2.2.2 重复性试验 取同一批标准汤剂，按“2.1.1”项下方法平行制备6份供试品溶液，在“2.2.1”项色谱条件下进样测定，测得各共有峰峰面积RSD为0.44%～1.76%，表明该方法重复性良好。

2.2.2.3 稳定性试验 取“2.1.1”项下同一份供试品溶液，于0、2、4、8、12、24 h在“2.2.1”项色谱条件下进样测定，测得各共有峰峰面积RSD为0.17%～1.87%，表明溶液在24 h内稳定性良好。

2.2.3 图谱生成 取“2.1.1”项下供试品溶液，在“2.2.1”项色谱条件下进样测定，将数据导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012版)”，结果见图3～4。以S1为参照，对15批药材特征图谱进行共有峰标识，并进行峰匹配，选择出峰稳定，峰形、分离度较好的6个共有峰作为特征峰(峰5为紫丁香苷)；15批标准汤剂特征图谱以S1为参照，多点校正后对共有峰进行Mark匹配，并进行相似度分析，结果见表3，可知除S1外其他批次标准汤剂的相似度均大于0.9，具有良好的相似度。

表3 15批标准汤剂相似度

以5号峰(紫丁香苷)为参照(S)，测得各共有峰相对保留时间RSD为0～0.72%，但相对峰面积差异较大，见表4。考虑到药材在运输、储存等不同环节存在的其他因素，故不限定其特征图谱的相对峰面积范围。

2.2.4 聚类分析 将15批标准汤剂中各共有峰的峰面积进行量化处理，通过SPSS 20.0软件进行聚类分析[11]，结果见图5。由此可知，当刻度距离为20时，可分为2类，S2～S4、S6～S15聚为1类，S1、S5聚为1类，其中后两者产地均为河南，并且紫丁香苷含量更高。

2.2.5 主成分分析 将15批标准汤剂中各共有峰的峰面积进行量化处理，通过SPSS 20.0软件进行主成分分析[12-14]，以特征值>1为提取标准得到2个主成分，累积方差贡献率为83.542%，可代表共有峰大部分信息，见图6。图7、表5显示，S1、S5分布比较离散，与其他样品差异较大，可能与紫丁香苷含量有关，与聚类分析结果一致。

表5 15批标准汤剂主成分分析得分系数矩阵

2.3 配方颗粒HPLC特征图谱建立 在“2.2.1”项色谱条件下建立3批配方颗粒(210601，编号P1；210602，编号P2；210603，编号P3)、标准汤剂(S5)的HPLC特征图谱，结果见图8、表6～7。由此可知，3批配方颗粒特征图谱均呈现与S5相同的6个共有峰，并且其相对保留时间、相对峰面积基本一致，均处于标准汤剂质量标准规定范围内，符合要求；多点校正后进行共有峰Mark匹配，测得相似度分别为0.993、0.986、0.989，均大于0.98。

表6 3批配方颗粒、标准汤剂(S5)中共有峰相对保留时间

表7 3批配方颗粒、标准汤剂(S5)中共有峰相对峰面积

3 讨论

紫丁香苷是槲寄生主要有效成分，专属性较强[15-16]，故本实验选择该成分作为指标建立HPLC特征图谱。

结果显示，除S1外其他14批标准汤剂特征图谱与对照图谱的相似度均大于0.9，表明各批次之间相似度较好，并且3批配方颗粒特征图谱均呈现与S5标准汤剂相同的6个共有峰。再依据配方颗粒与标准汤剂相对保留时间、相对峰面积、特征图谱相似度评价结果进行量值传递评价[17-18]，发现其特征图谱量值得到稳定传递，基本保证了配方颗粒与标准汤剂的一致性。

4 结论

本实验以槲寄生标准汤剂出膏率、紫丁香苷含量及转移率、特征图谱为表征，衡量了槲寄生配方颗粒与标准汤剂的一致性，阐明了前者与药材、标准汤剂在化学成分上的相关性，克服了依靠单一成分进行评价的缺点，能全面反映该制剂内在质量，为其替代传统汤剂提供了研究基础。