复方西羚解毒胶囊中5种成分在大鼠血浆中体内药动学研究

罗 毅， 刘子夜， 姚元成， 耿绍轩， 曹桂云*， 孟兆青,*

(1.山东中医药大学，山东 济南 250000；2.山东宏济堂制药集团股份有限公司，山东 济南 250000；3.山东省中医药治疗呼吸系统疾病技术创新中心，山东 济南 250000)

复方西羚解毒胶囊是在《温病条辨》经典方剂银翘散的基础上，增加了羚羊角、水牛角粉、冰片衍化而来，用于治疗外感风热、发热、头痛、咳嗽音哑、咽喉肿痛，被《山东省新型冠状病毒感染的肺炎中医药诊疗方案》《山东省中医疫病防治方案(2022冬春季补充版)》推荐为新型冠状病毒及其奥密克戎变异株的防治用药。前期课题组采用LC-MS法从复方西羚解毒胶囊中分离得到145种成分，主要为黄酮、酚酸、三萜类型[1]，并对其含量进行测定[2]。

中药口服后吸收进入血液，并能达到一定血药浓度的成分才能发挥药理作用[3-5]，而复方西羚解毒胶囊组成非常复杂，哪些成分能吸收入血，其药动学情况如何尚不明确。因此，本实验对复方西羚解毒胶囊中甘草苷、异甘草苷、甘草酸、芒柄花素、牛蒡子苷元在大鼠血浆中的体内药动学进行研究，以期为该制剂药理活性及临床作用研究提供参考。

1 材料

1.1 仪器 Agilent超高效液相系统(配置Agilent 1290 infinityⅡ二元泵、Agilent 1290 infinityⅡ自动进样器、Agilent 1290 infinityⅡ柱温箱)、Agilent G6530 Q TOF质谱仪(配置电喷雾离子源)(美国Agilent公司)；BSA224S-CW电子天平[万分之一，赛多利斯科学仪器(北京)有限公司]；XS105电子天平[十万分之一，梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司]；PS-60AL超声波清洗器(山东东岳国际经贸合作股份有限公司)；GTR22-1型高速低温离心机(北京时代北利离心机有限公司)。

1.2 试剂与药物 复方西羚解毒胶囊(批号1802005)由山东宏济堂制药集团股份有限公司生产。芒柄花素(批号200328-161026，纯度100%)、葛根素(内标，批号110752-201816，纯度95.4%)对照品购自中国食品药品检定研究院；甘草苷(批号102561，纯度98.5%)、牛蒡子苷元(批号100686，纯度98%)、甘草酸(批号102574，纯度98.5%)对照品购自江苏永健医药科技有限公司；异甘草苷(批号Y-008-181216，纯度98%)对照品购自成都瑞芬思生物科技有限公司。色谱纯乙腈购自Thermo Fisher Scientific公司；分析纯甲酸购自天津市科密欧化学试剂有限公司；屈臣氏纯净水购自屈臣氏集团(香港)有限公司。

1.3 动物 SPF级SD大鼠，雄性，体质量230～250 g，购自济南朋悦实验动物繁育有限公司，动物生产许可证号SCXK(鲁)20190003，于光暗周期12 h的环境下饲养，保持室内温度(25±1)℃，相对湿度(50±10)%，给予清洁级普通大鼠饲料饲养，实验前12 h禁食不禁水。

2 方法与结果

2.1 对照品、内标溶液制备 精密称取芒柄花素、甘草苷、异甘草苷、甘草酸、牛蒡子苷元、葛根素对照品适量，甲醇溶解制成贮备液，分别精密量取适量，甲醇稀释成系列质量浓度的对照品溶液，具体见表1。另外，精密称取葛根素对照品适量，甲醇溶解定容并稀释至3 μg/mL，即得内标溶液。

表1 对照品溶液质量浓度

2.2 给药与采样 取胶囊内容物粉末100 g，10倍量纯化水超声提取3次，每次1 h，滤过，合并续滤液，旋蒸浓缩，在-20 ℃下放置12 h后冷冻干燥48 h，得干浸膏50 g，取适量，用去离子水分散均匀，作为药液。取大鼠30只，眼眶后静脉丛取血，置于肝素化EP管中，8 000 r/min离心10 min，即得空白血浆。

另取大鼠84只，随机分为14组，每组6只，灌胃给予药液(4.0 g/kg)，于10 min、30 min、1 h、1.5 h、2 h、3 h、4 h、5 h、6 h、7 h、8 h、10 h、12 h、24 h眼眶后静脉丛取血各1.5 mL，置于肝素化EP管中，8 000 r/min离心10 min，即得含药血浆，在-20 ℃下保存。

2.3 样品处理 取大鼠血浆800 μL，加入内标溶液10 μL、甲醇-乙腈(2∶1)混合溶剂4 mL，混匀，涡旋30 s，超声处理2 min，12 000 r/min离心10 min，取上清液置于10 mL EP管中，在45 ℃下用N2吹干，分2次加入上述混合溶剂，每次400 μL，超声处理2 min溶解残渣，合并2次溶液，置于1.5 mL EP管中，45 ℃ N2吹干，加入100 μL甲醇，超声处理2 min溶解残渣，12 000 r/min离心10 min，取上清液，进样5 μL分析。

2.4 UPLC-MS条件

2.4.1 色谱 流动相乙腈-0.1%甲酸，梯度洗脱(0～13 min，21%乙腈；13～14 min，21%～42%乙腈；14～32 min，42%乙腈)；体积流量0.4 mL/min。

2.4.2 质谱 电喷雾离子源(ESI)，负离子模式；扫描范围m/z50～1 700；毛细管电压3 500 V；出口电压175 V；干燥气(N2)体积流量8 L/min；干燥器温度300 ℃；雾化器压力35 psi(1 psi=6.895 kPa)，采用Masshunter Qualitative Analysis B.08.00处理实验数据。通过提取离子色谱图进行积分，各成分提取离子([M-H]-)分别为m/z267.065 7(芒柄花素)、m/z255.065 7(甘草苷)、m/z255.065 7(异甘草苷)、m/z821.396 0(甘草酸)、m/z371.149 5(牛蒡子苷元)，内标提取离子([M-H]-)m/z415.103 5。

2.5 方法学考察

2.5.1 质控样品制备 取对照品溶液适量，45 ℃ N2吹干，加入空白血浆800 μL、内标溶液10 μL，按“2.3”项下方法处理，即得。

2.5.2 专属性考察 取空白血浆适量，除不加内标外按“2.3”项下方法处理；取对照品溶液适量，45 ℃ N2吹干溶剂，加入空白血浆800 μL，按“2.3”项下方法处理；取给药后4 h血浆适量，按“2.3”项下方法处理，在“2.4”项条件下进样测定，结果见图1。由此可知，内源性物质对各成分无干扰，表明该方法专属性良好。

2.5.3 线性关系考察 取“2.1”项下对照品溶液适量，45 ℃ N2吹干溶剂，加入空白血浆800 μL、内标溶液10 μL，按“2.3”项下方法处理，在“2.4”项条件下进样测定。以各成分质量浓度为横坐标(X)，各成分、内标峰面积比值为纵坐标(Y)进行回归，结果见表2，可知各成分在各自范围内线性关系良好。

表2 各成分线性关系

2.5.4 精密度、准确度试验 按“2.5.1”项下方法制备质控样品，各质量浓度平行6份，在“2.4”项条件下连续进样测定3 d，结果见表3。由此可知，各成分日内、日间精密度均小于15%，方法回收率均在85%～115%范围内，表明该方法精密度、准确度均良好。

表3 各成分精密度、准确度试验结果(n=6)

2.5.5 稳定性试验

2.5.5.1 室温稳定性 将质控样品在室温下密封放置24 h。

2.5.5.2 冻融稳定性 将质控样品在-20 ℃下密封放置24 h，再于37 ℃水浴中解冻，待完全融化后重新在-20 ℃下密封放置24 h，重复上述操作3次。

2.5.5.3 长期稳定性 将质控样品在-20 ℃下密封放置1个月。

2.5.5.4 结果分析 表4显示，各成分在不同条件下的准确度较高，表明质控样品稳定性良好。

表4 各成分稳定性试验结果(n=6)

2.5.6 回收率、基质效应试验 取空白血浆800 μL，加入“2.3”项下混合溶剂4 mL，混匀，涡旋30 s，超声处理2 min，12 000 r/min离心10 min，取上清液，置于10 mL EP管中，45 ℃ N2吹干，分2次加入上述混合溶剂，每次400 μL，超声处理2 min溶解残渣，合并2次溶液，置于1.5 mL EP管中，45 ℃ N2吹干，加入“2.1”项下对照品溶液适量，再加入内标溶液10 μL，45 ℃ N2吹干，加入甲醇100 μL，超声处理2 min溶解残渣，12 000 r/min离心10 min，取上清液，得到基质效应样品，以质控样品、对照品峰面积比值为回收率，基质效应样品、对照品峰面积比值为基质效应，结果见表5。由此可知，各成分回收率均符合生物样品检测萃取回收率要求，并且均无基质效应。

表5 各成分回收率、基质效应试验结果(n=6)

2.6 药动学研究 按“2.3”项下方法处理血浆样品，在“2.4 ”项条件下进样测定，计算不同时间点各成分血药浓度，再采用DAS 2.0软件，通过统计矩模型分析计算主要药动学参数，结果见表6、图2。由此可知，大鼠灌胃给药后各成分均能较快吸收入血，Tmax均为1 h，血药浓度-时间曲线呈多峰现象，但第2个峰的峰值浓度明显低于第1个峰，表明体内吸收均较快，可能存在肝肠循环[6-8]；异甘草苷t1/2最短，表明该成分体内消除较快，而其他4种成分消除速率中等[9]。

表6 各成分主要药动学参数

3 讨论与结论

LC-MS既具有高效液相的分离能力，又具有质谱的灵敏度和高选择性，近年来被越来越多地用于药物代谢成分研究[10-12]。因此，本实验采用该方法测定复方西羚解毒胶囊中甘草苷、异甘草苷、甘草酸、芒柄花素、牛蒡子苷元含量，发现其灵敏快速，简便准确，重复性好，在30 min内即出峰完毕。

结果显示，复方西羚解毒胶囊中甘草酸含量最高，可快速吸收入血，消除速率中等，具有显著的抗炎、抗病毒、抗变态反应、抗肿瘤活性[13-15]；黄酮类成分甘草苷、异甘草苷、芒柄花素含量较高，也可快速吸收入血，具有抗炎、抗溃疡、抗艾滋病病毒、抗肿瘤等多种作用[16-18]；牛蒡子苷元是牛蒡子中的单环氧木脂素类化合物，具有抗炎、免疫调节、抗病毒、抗肿瘤活性[19-20]。

综上所述，本实验对复方西羚解毒胶囊中甘草苷、异甘草苷、甘草酸、芒柄花素、牛蒡子苷元进行了药动学研究，可为阐明其物质基础提供重要参考依据。另外，该制剂还含有大量酚酸类成分，但由于其理化性质与上述5种成分有一定差异，故未进行相关研究，今后将作进一步考察。