高效液相色谱法测定饲料中黄霉素含量

郑 蓉，钭丽敏，鲁丁丁

钛和检测认证集团股份有限公司，上海 200060

黄霉素（Flavomycin）又称为斑伯霉素、默诺霉素A，是从灰绿链霉素菌（斑伯氏链丝菌）的发酵产物中分离的磷酸多糖类抗生素。黄霉素主要是通过干扰构成细胞壁的结构物质肽聚糖的生物合成而抑制细菌的繁殖[1]，对大多数的革兰氏阳性菌和部分革兰氏阴性菌有效。在水产养殖中的主要作用是通过影响肠道细菌的滋生，使肠道菌群的代谢活动变得有益于动物生长，间接改善了营养的消化和吸收，是一种新型的抗生素类药物添加剂或促生长剂[2-5]。

黄霉素至少含有5 种活性成分，其主要活性组分为黄霉素A，根据农业农村部兽药质量标准中的规定，其含量应大于总活性成分的50%，因此可以通过检测样品中黄霉素A 的含量来确定黄霉素用药情况。黄霉素A 的检测方法多采用配有紫外检测器的高效液相色谱仪（HPLC）或采用液相色谱-串联质谱仪进行测定（LC-MS/MS）[6-9]，液质联用仪虽然灵敏度高，但价格昂贵，基层检测实验室往往难以配置，且因饲料中黄霉素的含量高，用液相色谱仪就能进行精准检测。本研究对黄霉素液相色谱检测方法进行研究，黄霉素药物经色谱柱分离后可用紫外检测器进行定性定量分析。该方法的建立可以提供结果准确可靠的黄霉素残留测定，为养殖企业及时检测饲料中黄霉素含量提供技术支撑。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

1）甲醇、乙腈、正己烷，为色谱级试剂（美国Tedia公司），其余为分析纯试剂。黄霉素标准品（99%，中国兽医药品监察所）。

2）标准储备液：准确称取一定量的黄霉素标准品，分别用体积比1∶1 的甲醇水溶液超声溶解，配置成1 mg/mL 的标准储备液。

3）流动相缓冲液：分别准确称取3.0 g 庚烷基磺酸钠、l5.5 g 磷酸氢二钾、1.0 g 磷酸二氢钾，加水溶解后稀释至l 000 mL，用20%的磷酸溶液调节至pH 值为7.0±0.1。

4）Agilent 1100 高效液相色谱仪（美国安捷伦公司），配有紫外检测器，CF16RXⅡ型离心机（HITACHI 公司），旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）。

1.2 样品处理方法

称取（5.00±0.05）g 样品于50 mL 离心管中，加入5 mL 甲醇水（体积比1∶1）溶液，振荡5 min，50 ℃水浴超声提取30 min，4 000 r/min 离心5 min，将提取溶液转入另一离心管中，残渣按上述方法再提取1 次，合并提取液。在提取液中加入5 mL 正己烷振荡5 min，离心，去除上层，重复操作1 次，下层溶液过0.45 μm 水相滤膜，供高效液相色谱测定。

1.3 仪器分析方法

色谱柱：Agilent SB-C18（250 mm×4.6 mm，2.5 μm）；柱温：40 ℃；柱流速1.0 mL/min；运行时间：50 min；进样量50 μL；流动相为乙腈：缓冲液（35∶65，V/V）；检测波长256 nm。

2 结果与分析

2.1 方法线性范围与定量限

将1 mg/mL 的黄霉素标准储备液，用1∶1 的甲醇水溶液稀释成质量浓度分别为1.0、2.5、10、50、100 μg/mL 的标准工作液，取50 μL 标准溶液注入高效液相色谱仪中，按以上仪器条件进行分析，以黄霉素化合物的峰面积对应质量浓度做校准曲线。黄霉素药物的线性回归方程为：Y=6.786X+4.495，相关系数为0.997。

试验测得在黄霉素加标量为1.0 mg/kg 时，仪器信噪比＞3；加标量为2.0 mg/kg 时，仪器信噪比＞10，同时回收率＞70%，精密度≤15%，因此将1.0 mg/kg 确定为方法检测限，2.0 mg/kg 确定为定量限。

2.2 方法回收率与精密度

在阴性饲料样品中添加3 个水平的黄霉素标准溶液进行回收率试验，每个加标水平做6 个平行样。测定结果显示，平均添加回收率为83.9%～88.2%，相对标准偏差为4.40%～10.20%（表1），空白饲料样品加标样品色谱图见图1。

表1 饲料样品中添加黄霉素的平均回收率和精密度

3 讨 论

1）提取方法的选择。黄霉素为有机弱酸，易溶于水，因此确定将有机溶剂与水混合后作为提取剂。同时，采用加热超声的方法能使溶剂完全渗透饲料肌肉组织，促进黄霉素的溶出。本试验分别用纯甲醇、30%甲醇水、50%甲醇水和70%甲醇水作为提取剂，在50 ℃加热超声30 min，比较提取效率，结果回收率分别为58.2%、77.4%、89.3%、82.7%，50%甲醇水溶液提取效率略高。此外，考虑到水相比例高的情况下，用正己烷去脂效果更好，确定采用50%甲醇水溶液提取。

由于饲料样品中含有脂肪，需要对提取液净化，常用的样品净化方法包括液液萃取和使用固相萃取柱等，黄霉素药物结构中有羟基，可以采用阴离子柱或C18 柱固相萃取净化的方法，但是过柱净化时间较长，操作步骤复杂。因此，利用黄霉素药物不易溶于正己烷的性质，采用液液萃取的方式。试验采取在50%的甲醇水溶液中添加黄霉素标准溶液，用5 mL 正己烷去脂2 遍，下层溶液上机测定，来考察正己烷去脂带来的损失，结果回收率为99.6%，几乎没有损失。因此，可以采用在提取液中加入正己烷进行液液萃取的方法对样品提取液进行净化。

2）仪器条件的优化。选择高效液相色谱法较为常用的C18 柱作为色谱柱，结果发现黄霉素在Agilent SB-C18 色谱柱上能获得理想的分离效果，再采用2种仪器条件进行分析。A 的流动相采用药典中推荐的0.2%甲酸铵与乙腈以45∶55 的体积比混合，紫外吸收波长为258 nm。B 的流动相采用离子对试剂庚烷磺酸钠、磷酸二氢钾与磷酸氢二钾的混合液与洗脱能力较强的试剂乙腈以35∶65 的体积比混合。按B 方法分析的黄霉素峰形更好，稳定性好，同时有效成分黄霉素A 与其他组分完全分离（图1）。庚烷磺酸钠在水中电离成庚烷磺酸钠负离子，与胺类电离成的胺正离子结合，黄霉素分子中含有胺基，与庚烷磺酸钠形成离子对，使各组分间得到很好分离。黄霉素在流动相中完全电离受pH 值及离子对试剂浓度影响较大。本试验对流动相的pH 值、离子对试剂浓度、流速以及配比均进行了优化，最后确定最佳仪器条件。

本试验通过对色谱条件的优化和样品前处理方法的筛选，建立了饲料中黄霉素残留量的高效液相色谱方法，该方法操作简便，准确度和精密度均能满足方法要求，可实现对饲料中黄霉素残留含量的快速检测。