大孔吸附树脂分离纯化羊肚菌多糖过氧化氢改性物

张雪松， 谢春芹， 凡军民， 曹 正， 舒 瑾， 苗 雪

(江苏农林职业技术学院茶与食品科技学院，江苏 句容 212400)

糖尿病是因胰岛素分泌不足或胰岛素作用障碍而导致的内分泌类代谢性疾病，糖苷酶抑制剂因其效果持久、毒副作用小、作用温和等优点广泛运用于2型糖尿病的治疗[1]。近年来，对天然植物来源的糖苷酶抑制剂展开的研究成为热点[2]。很多中药包括食药用菌提取物有降糖作用，多糖成分在其中起着重要作用[3-4]。羊肚菌属珍稀食药用菌，羊肚菌多糖具有降血脂、降血糖、抗肿瘤等作用[5-7]。

抑制α-淀粉酶活性的试剂可用于抑制肠道内的淀粉酶活性，阻碍碳水化合物的水解，对高血糖、肥胖症以及高血脂等具有较好的防治作用[8]。糖苷酶抑制剂中，食用菌多糖来源广泛，但其生物活性很难与药物相提并论，限制其应用前景。研究表明，食用菌多糖的糖苷键类型、分子量大小等因素均能影响其生物活性，通过改变分子量、空间结构等可以改变食用菌生物活性的有效途径[9]。课题组前期采用过氧化氢氧化降解羊肚菌多糖组分，提高其对α-淀粉酶的抑制活性[10]。本实验以α-淀粉酶抑制率为指标，利用大孔树脂分离纯化羊肚菌多糖过氧化氢改性物，通过筛选D101、AB-8、S-8、NKA-9、LX-17大孔树脂，考察羊肚菌多糖的分离纯化影响因素和工艺条件，以期为后续天然来源的糖苷酶抑制剂的工业化应用提供参考。

1 材料

1.1 试剂与药物 六妹羊肚菌由江苏农林职业技术学院食用菌教学基地种植，经专家鉴定为正品。20 000 U/mL α-淀粉酶购自上海麦克林生化科技有限公司；氯仿、淀粉、3, 5-二硝基水杨酸(DNS)、过氧化氢为分析纯，购自国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器 GZLYZ-1型真空冷冻干燥机(诸城市博汇机械有限公司)；Thermo Nicolet 5700型傅里叶红外光谱仪(美国Thermo公司)；T6型紫外-可见分光光度计(北京普析通用仪器有限责任公司)；SY-5000型旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂)。

2 方法

2.1 多糖制备 新鲜羊肚菌灭菌烘干后粉碎过40目筛，参考文献[10]报道制备多糖，经真空冷冻后为黄色粉末，提取率为10.32%。

2.2 多糖改性物制备 参考文献[10]报道，称取多糖1 g，按最佳条件用30%过氧化氢氧化降解羊肚菌多糖，反应液经浓缩、真空冷冻干燥得白色粉末状改性物0.854 2 g，得率为85.42%。

2.3 α-淀粉酶抑制活性研究 参考文献[11]报道，取抑制对照管和抑制管，分别加入0.5 mL 2%淀粉溶液和40 mg/L 1.0 mL羊肚菌多糖改性物溶液，取空白对照管和空白管，分别加入蒸馏水1.0 mL，再在抑制对照管加入蒸馏水0.5 mL，抑制剂管和空白管各加入α-淀粉酶(20 U/mL)0.5 mL，37 ℃水浴10 min，再加入DNS试剂1.0 mL，沸水浴加热5 min后加入蒸馏水10.0 mL。冷却至室温后在540 nm波长处测定吸光度(A)，计算抑制率(InR)，公式为InR=[1-(A3-A4)/(A1-A2)]×100%。

2.4 分离纯化研究

2.4.1 预处理 选用AB-8、LX-17、D101、NKA-9、S-8树脂，分别用95%乙醇浸泡24 h后淋洗，最后用蒸馏水冲洗。

2.4.2 树脂筛选 取上述5种树脂各5 g，置于于锥形瓶中，加入40 mg/L多糖改性物溶液100 mL，在30 ℃、100 r/min下吸附24 h，计算吸附率，公式为吸附率=[(初始溶液抑制率-吸附后溶液抑制率)/初始溶液抑制率]×100%。

2.4.3 静态吸附实验 参考文献[12]报道。

2.4.3.1 吸附时间 称取预处理好的D101树脂5 g，加入40 mg/L多糖改性物溶液100 mL，在30 ℃ 100 r/min下吸附12 h，每隔1 h测定溶液对α-淀粉酶的抑制率。

2.4.3.2 吸附温度 称取预处理好的D101树脂5 g，加入40 mg/L多糖改性物溶液100 mL，分别在20、25、30、35、40 ℃下吸附3 h，测定溶液对α-淀粉酶的抑制率。

2.4.3.3 树脂用量 分别称取预处理好的D101树脂1、2、3、4、5 g，加入40 mg/L多糖改性物溶液100 mL，在35 ℃下吸附3 h，测定溶液对α-淀粉酶的抑制率。

2.4.4 动态吸附实验 参考文献[13]报道。

2.4.4.1 pH值 称取预处理好的D101树脂10 g装柱，用5% NaOH或5%HCl调节多糖改性物溶液至pH值为4、5、6、7、8，倒入100 mL溶液上样，控制体积流量为2 BV/h，通过2 BV 95%乙醇进行洗脱，洗脱液旋蒸后定容到100 mL，测定其对α-淀粉酶的抑制率。

2.4.4.2 洗脱剂体积分数 称取预处理好的D101树脂10 g装柱，倒入100 mL pH值为7的多糖改性物溶液上样，控制体积流量为2 BV/h分别通过2 BV 20%、40%、60%、80%、100%乙醇洗脱，洗脱液旋蒸后定容到100 mL，测定其对α-淀粉酶的抑制率。

2.4.4.3 洗脱剂用量 称取预处理好的D101树脂10 g装柱，倒入100 mL pH值为7的多糖改性物溶液上样，控制体积流量为2 BV/h，通过100 mL 80%乙醇洗脱，每1 BV(25 mL)收集1次洗脱液，旋蒸后定容至100 mL，测定其对α-淀粉酶的抑制率。

2.4.4.4 上样质量浓度 称取预处理好的D101树脂10 g装柱，倒入100 mL pH值为7的多糖改性物溶液上样，质量浓度分别为20、30、40、50、60 mg/L，控制体积流量为2 BV/h，通过80%乙醇2 BV洗脱，洗脱液旋蒸后定容到100 mL，测定其对α-淀粉酶的抑制率。

2.4.4.5 上样体积流量 称取预处理好的D101树脂10 g装柱，倒入100 mL、pH值为7、质量浓度为30 mg/L的多糖改性物溶液上样，控制体积流量为1、2、3、4、5 BV/h，通过用80%乙醇2 BV洗脱，洗脱液旋蒸后定容到100 mL，测定其对α-淀粉酶的抑制率。

2.5 红外光谱扫描分析 多糖改性物及D101树脂洗脱产物冷冻干燥样品磨成粉末后与溴化钾混合，压片，在4 000～5 00 cm-1波数范围内进行红外光谱扫描分析。

3 结果

3.1 树脂筛选 由表1可知，多糖改性物溶液被树脂吸附后，对α-淀粉酶的抑制活性均有所降低，并且差异较大，其中D101吸附后最低，相对吸附率为61.96%，即吸附效果最好。

表1 5种树脂吸附作用比较

3.2 静态吸附分析

3.2.1 吸附时间 由图1可知，前3 h内α-淀粉酶抑制率下降最快，当吸附时间超过3 h后变化不大，说明吸附在3 h后已达到饱和。Ho等[14]发现，大孔吸附树脂的吸附分为4个过程，在吸附的前3 h，树脂对多糖改性物中α-淀粉酶抑制成分的吸附主要是在位于表面的活性中心上，主要是通过在溶液以及液膜中的扩散，在树脂表面即被吸附，而吸附时间超过3 h以后，树脂表面α-淀粉酶抑制成分吸附量逐渐饱和，多糖改性可通过树脂的内部孔道扩散到树脂的内表面上，由于树脂内部扩散阻力较大，吸附过程趋于平缓直至饱和。

图1 吸附时间对α-淀粉酶抑制率的影响

3.2.2 吸附温度 由图2可知，随着吸附温度从20 ℃上升到40 ℃，多糖改性物溶液对α-淀粉酶的抑制率先降低再升高；当吸附温度为35 ℃时，溶液对α-淀粉酶的抑制活性最低，为5.51%。温度升高会加快分子运动，有效的降低溶液黏度，减小外扩散和内扩散的阻力，有利于吸附和扩散过程的进行。

图2 吸附温度对α-淀粉酶抑制率的影响

3.2.3 树脂用量 由图3可知，随着树脂用量上升，α-淀粉酶抑制率逐渐下降，为4 g时最低，此时吸附趋于饱和，超过4 g后基本不变。

图3 树脂用量对α-淀粉酶抑制率的影响

3.3 动态吸附分析

3.3.1 pH值 由图4可知，随着pH值增大，α-淀粉酶抑制率先升高后降低，为7时最高，达24.36%，这可能是由于多糖改性产物分子中存在羟基，在酸性条件下容易质子化，从而削弱和水分子之间的作用力，树脂吸附力下降，洗脱液对α-淀粉酶的抑制活性下降；但pH过大，大孔树脂也容易结成块状物，不利于对样品进行吸附[15]。

图4 pH值对α-淀粉酶抑制率的影响

3.3.2 洗脱剂体积分数 由图5可知，随着乙醇体积分数不断增加，洗脱液对α-淀粉酶的抑制率呈现出先升高后降低的趋势，为80%时最高，达27.87%，说明在该体积分数下洗脱得到的目标成分最多。使用非极性D101大孔树脂时，洗脱剂的极性越小，洗脱能力越强[16]，同时，经过氧化氢氧化降解后羊肚菌多糖改性物分子量相对较小，在不同体积分数乙醇中的溶解度也存在较大差异。

图5 洗脱剂体积分数对α-淀粉酶抑制率的影响

3.3.3 洗脱剂用量 由图6可知，经2 BV乙醇洗脱后，洗脱液对α-淀粉酶的抑制率最高，达36.21%，即洗脱的目标成分最多。洗脱剂用量过少，则洗脱不完全；洗脱剂用量过多，洗脱液中α-淀粉酶抑制物质浓度将会下降，会降低其抑制效果。

图6 洗脱剂用量对α-淀粉酶抑制率的影响

3.3.4 上样质量浓度 由图7可知，随着上样质量浓度的增大，洗脱液对α-淀粉酶的抑制率呈现出先升高后降低的趋势，其原因可能是上样质量浓度较低时，多糖改性物溶液中的α-淀粉酶抑制物质与树脂内表面接触机会减少，扩散到树脂表面以及孔道内的速度较慢，影响吸附的效果；随着上样质量浓度的增加，多糖改性物溶液中α-淀粉酶抑制物质与树脂内表面接触机会逐渐增加，更多前者被树脂吸附并洗脱，洗脱液抑制活性提高，但若上样质量浓度过高，多糖改性物溶液中其他物质可能会与α-淀粉酶抑制物质形成吸附竞争关系，甚至形成沉淀而造成孔道堵塞，降低扩散速率，影响吸附效果，同时当树脂吸附达到饱和以后，单纯地增加上样质量浓度对提高洗脱液的α-淀粉酶抑制率影响不大。本实验发现，上样质量浓度为30 mg/L时，对α-淀粉酶的抑制率达到最高，为40.33%。

图7 上样质量浓度对α-淀粉酶抑制率的影响

3.3.5 上样体积流量 由图8可知，随着上样体积流量的上升，洗脱液对α-淀粉酶的抑制率先升高后降低，为1～3 BV/h时较高，为2 BV/h时最高，为40.33%。上样体积流量过大，多糖改性物溶液中α-淀粉酶抑制物质在树脂层停留的时间就会短，与树脂的接触时间减少，吸附效果降低，洗脱液对α-淀粉酶的抑制率就会随着体积流量的增加而减小；上样体积流量过小，则会延长试验和生产时间，不利于经济生产。

图8 上样体积流量对α-淀粉酶抑制率的影响

3.4 分离纯化前后样品表征 由图9可知，羊肚菌多糖改性物及其D101树脂洗脱物均在1 150 cm-1左右处出现环上C-O吸收峰，1 630 cm-1左右处出现-OH弯曲振动吸收峰、2 920 cm-1左右处出现C-H伸缩振动吸收峰，3 420 cm-1左右处出现-OH伸缩振动吸收峰等多糖的典型吸收特征，说明采用D101大孔树脂分离纯化多糖过氧化氢降解改性产物所得洗脱物仍然具有典型的多糖结构。

图9 分离纯化前后傅里叶红外光谱图

4 讨论

本实验通过筛选D101、AB-8、S-8、NKA-9、LX-17大孔吸附树脂对羊肚菌多糖改性物中α-淀粉酶抑制组分的吸附效果，确定D101大孔树脂为目标树脂。结果，最佳纯化条件为上样质量浓度30 mg/L，pH值7，吸附温度35 ℃，树脂用量4 g，上样体积流量2 BV/h，2 BV 80%乙醇洗脱，洗脱产物对α-淀粉酶抑制率为40.33%，相较纯化前提高了2.45倍。红外图谱表明，纯化后的洗脱物仍具有多糖的吸收特征。本实验用5倍上样量及树脂用量进行放大验证，重复3次测得洗脱产物的平均收率为50.17%，对α-淀粉酶的抑制率为40.95%，基本与放大前相当。

目前，分离纯化常用的方法有超临界CO2法、色谱法等，但工艺相对较为复杂，成本较高[17]。大孔树脂比表面积较大，并且具有优良网状结构，在萜类、黄酮类以及苷类等各种天然产物活性成分分离纯化领域应用广泛[18]。本实验针对羊肚菌多糖改性物溶液中α-淀粉酶抑制物质所建立的大孔树脂分离纯化工艺合理、简单可行，并且分离纯化效果较好，为进一步研究羊肚菌多糖及其改性物组分降糖能力提供依据。结果，分离纯化羊肚菌多糖过氧化氢改性产物所得洗脱物仍然具有典型的多糖结构，利用D101大孔树脂进行了初步的分离提纯。下一步，将结合凝胶层析技术，获取具有较高α-淀粉酶抑制活性且组分较为单一的多糖成分，为后续羊肚菌多糖及其改性产物的组成、结构以及活性分析提供基础。