黑逍遥散通过调控PP2A/GSK-3β通路对阿尔茨海默病大鼠的改善作用

王虎平， 米彩云， 周 君， 李明成

(甘肃中医药大学，甘肃省中医方药挖掘与创新转化重点实验室，甘肃 兰州 730000)

阿尔茨海默病是神经系统常见的一种退行性疾病，临床表现为渐进性认知障碍、记忆力损害、语言障碍等神经精神症状[1]。据《2019年全球卫生估计报告》统计，全世界约有5 000万人患有阿尔茨海默病，给患者、家庭和社会造成沉重的经济负担和精神压力。

阿尔茨海默病的发病机制复杂，尚未完全阐明。β-淀粉样蛋白(β-amyloid，Aβ)沉积和Tau蛋白过度磷酸化形成的神经原纤维缠结是其2个重要病理特征[2]。尽管在过去20年中对靶向Aβ进行了广泛的研究，但未能证明其在治疗阿尔茨海默病方面的有效性[3-4]，而Tau蛋白在多种神经退行性疾病中被证明具有广泛的作用[5-7]，是治疗阿尔茨海默病有前途的候选靶点。因此，本实验探讨黑逍遥散通过调控蛋白质磷酸酶2A(protein phosphatase 2A，PP2A)/糖原合酶激酶-3β(glycogen synthase kinase-3β，GSK-3β)信号通路抑制Tau蛋白过磷酸化，以期为临床应用黑逍遥散防治阿尔茨海默病提供实验支撑。

1 材料

1.1 动物 SPF级4月龄健康雄性Wistar大鼠110只，体质量(250±50)g，购自甘肃中医药大学动物实验中心，实验动物生产许可证号SCXK(甘)2015-0005。大鼠饲养于甘肃中医药大学SPF级动物实验中心，实验动物使用许可证号SYXK(甘)2015-0005，饲养环境为温度(23±2)℃，相对湿度40%～60%，光照时间7：00～19：00，自由饮水，正常喂养，实验经甘肃中医药大学实验动物伦理委员会审查通过(编号2020-034)。

1.2 药物 黑逍遥散(熟地15 g、柴胡10 g、当归10 g、白芍10 g、白术10 g、茯苓10 g、生姜10 g、炙甘草8 g、薄荷2 g)，饮片购自甘肃中医药大学附属医院门诊，经甘肃中医药大学安耀荣教授鉴定为正品。依据2015年版《中国药典》和《医略六书·女科指要》指导，熟地、柴胡、当归、白芍、茯苓、白术、生姜、甘草、薄荷按7.5∶5∶5∶5∶5∶5∶5∶4∶1的比例称取药物，加入10倍量冷水浸泡30 min，武火煮沸，文火慢熬1 h，薄荷后下煎煮5 min，搅拌后趁热过滤药液，将剩余药渣再加6倍量水煎煮30 min，过滤后合并2次药液，浓缩至生药量为2.0 g/mL的黑逍遥散水煎剂，4 ℃保存备用。盐酸多奈哌齐(5 mg×7片/板，2板/盒，国药准字H20183417)，购自甘肃中医药大学附属医院门诊，于研钵中研为粉末，充分溶解于蒸馏水中，配制成0.005 mg/mL溶液。

1.3 试剂与仪器 Aβ1-42(上海强耀生物科技有限公司，批号04010011827)；高尔基染液套装(武汉赛维尔生物科技有限公司，批号G1069)；Tau、PP2A、GSK-3β酶联免疫吸附测定法(ELISA)试剂盒(上海茁彩生物科技有限公司，批号YY56922、YY98455、YY69712)。Morris水迷宫视频分析系统(成都泰盟科技有限公司，型号MT-200)；酶标仪(美国赛默飞公司，型号Multiskan Mk3)；正置光学显微镜(日本尼康公司，型号Eclipse E100)；振动切片机(德国徕卡公司)。

2 方法

2.1 模型建立 参照《大鼠脑立体定位图谱》，在大鼠左右海马CA1区各注入1 μL Aβ1-42溶液复制阿尔茨海默病大鼠模型；假手术组大鼠同位点注射等量生理盐水。

2.2 分组及给药 110只大鼠随机选取12只作为空白组；12只作为假手术组，双侧海马注射1 μL生理盐水；其余86只作为造模组，双侧海马注射1 μL Aβ1-42溶液复制模型。选取造模成功的大鼠60只，随机分为模型组，黑逍遥散低、中、高剂量组，盐酸多奈哌齐组。黑逍遥散低、中、高剂量组根据人和大鼠体表面积折算的等效剂量比值换算，灌胃给予4.25、8.5、17 g/kg药物；盐酸多奈哌齐组灌胃给予0.5 mg/kg药物；空白组和假手术组灌胃给予等量生理盐水，每天1次，连续42 d。

2.3 Morris水迷宫行为学实验 平台随机放置在一个象限的中央，将大鼠头朝池壁随机放入东、西、南、北4个起始位置之一，记录大鼠找到水下平台的时间，如果寻找时间超过60 s，则引导大鼠到平台，使其在平台上停留20 s。每只大鼠每天训练4次，2次训练之间间隔15～20 min，连续训练5 d。最后1次定位航行训练结束后的第2天，将平台撤除，开始60 s的探索训练，即将大鼠由原先平台象限的对侧放入水中，记录大鼠进入目标象限所花的时间和穿越平台的次数，以此作为空间记忆的评价指标。

2.4 高尔基染色观察海马CA1区中树突棘数量和形态结构变化 将海马组织分别放入配置好的高尔基染色试剂盒固定液(A液)中固定0.5～4 h，用徕卡振动切片机将脑片切至150 μm，各组选取海马结构清晰且质量好的第3～7张脑片作为观察对象，之后置于浸渍液(B液)浸泡2～3 d，转移到染色液(C液)中不超过1 min，显色液(D液)显色，30 s内明胶封片，显微镜下观察分析神经元情况，其中每10 μm树突棘的个数记作树突棘密度。

2.5 ELISA法检测大鼠血清及海马中Tau、PP2A、GSK-3β水平 取大鼠血清及海马组织，按照相应ELISA试剂盒说明书进行检测，用酶标仪在450 nm波长测定各孔的光密度(OD)值，根据标准曲线计算各组大鼠血清及海马中Tau、PP2A、GSK-3β水平。

3 结果

3.1 大鼠一般情况 空白组大鼠正常喂养，反应灵敏，进食正常；造模72 h后，假手术及造模大鼠活动与摄食量明显减少，精神萎靡，毛色黯淡，共死亡3只；分组给药1周后，盐酸多奈哌齐组死亡2只，逍遥散高剂量组死亡4只，中剂量组死亡3只，低剂量组死亡2只，假手术组死亡3只，模型组死亡4只。

3.2 黑逍遥散对大鼠学习记忆能力的影响 与空白组比较，假手术组大鼠第5天逃避潜伏期均延长(P<0.01)，大鼠游泳总路程、目标象限滞留时间百分比无明显变化(P>0.05)；与假手术组比较，模型组大鼠第5天逃避潜伏期延长(P<0.01)，游泳总路程增加(P<0.01)，目标象限停留时间百分比降低(P<0.01)；与模型组比较，盐酸多奈哌齐组及黑逍遥散高、中剂量组大鼠第5天逃避潜伏期缩短(P<0.01)，游泳总路程减少(P<0.01)，目标象限停留时间百分比提高(P<0.01)，而黑逍遥散低剂量组均无明显变化(P>0.05)，见表1～2。

表1 黑逍遥散对大鼠定位航行能力的影响

表2 黑逍遥散对大鼠空间探索能力的影响

3.3 黑逍遥散对大鼠海马CA1区中树突棘数量和形态结构的影响 与空白组比较，假手术组大鼠海马CA1区神经元树突棘密度减少(P<0.01)，树突分支数量无明显变化(P>0.05)；与假手术组比较，模型组大鼠海马CA1区神经元树突棘密度和树突分支数量减少(P<0.01)；与模型组比较，盐酸多奈哌齐组和黑逍遥散各剂量组海马CA1区神经元树突棘密度和树突分支数量均增加(P<0.05，P<0.01)，见图1～2、表3。

表3 黑逍遥散对大鼠海马CA1区树突棘密度及树突分支的影响

3.4 黑逍遥散对大鼠血清及海马Tau、PP2A、GSK-3β水平的影响 与空白组比较，假手术组大鼠海马中Tau水平升高(P<0.01)，血清及海马中PP2A、GSK-3β水平未见明显变化(P>0.05)；与假手术组比较，模型组大鼠血清及海马中Tau、GSK-3β水平升高(P<0.01)，PP2A水平降低(P<0.01)；与模型组比较，盐酸多奈哌齐组及黑逍遥散高、中剂量组大鼠血清及海马中Tau、GSK-3β水平降低(P<0.01)，PP2A水平升高(P<0.05，P<0.01)，黑逍遥散低剂量组血清中Tau、GSK-3β水平降低(P<0.01)，PP2A水平升高(P<0.01)，海马中Tau水平降低(P<0.01)，见表4。

表4 黑逍遥散对大鼠血清及海马中Tau、PP2A、GSK-3β水平的影响

4 讨论

阿尔茨海默病属中医“呆病”“痴呆”等范畴，认为其病位在脑，与肾虚密切相关，总属本虚标实，本虚者人老体弱，五脏虚衰，精血不足，脑窍失养；标实者气滞血瘀，痰湿阻滞，蒙闭清窍，故治疗该病基本以补肾为主，课题组在此基础上进一步提出了从“肝脾肾三脏并调”防治阿尔茨海默病的思路。黑逍遥散出自《医略六书·女科指要》，由逍遥散加熟地而成，全方补肾填精，健脾促运，疏肝养血，精血并补，气血同调，补泻兼施，可针对肝、脾、肾三脏防治痴呆，其疗效在课题组前期研究中已被证实[8-10]。

细胞内的神经纤维缠结是阿尔茨海默病的重要病理特征，主要是由过度磷酸化的微管相关蛋白Tau聚集成的双螺旋细丝结构[11]，具体分子机制还不清楚，目前认为由于蛋白磷酸酶与蛋白激酶的调节失衡直接导致了Tau的过度磷酸化[12]。因此，PP2A和GSK-3β作为重要的磷酸酶和激酶，两者活性的平衡是描述Tau去磷酸化/磷酸化状态的关键因素[13-14]。研究表明，在阿尔茨海默病患者脑内，与Tau蛋白脱磷酸化相关的所有丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酯酶中，PP2A的活性比例约占70%，且PP2A活性显著降低[15-16]；GSK-3β在患者脑组织中多处都有大量的集聚，包括老年斑、神经原纤维缠结的神经元、星形胶质细胞、神经毡细丝、螺旋体等[17-18]，能够直接磷酸化Tau蛋白的丝氨酸/苏氨酸位点，加速神经原纤维缠结的形成[19]。有研究报道，激活小鼠脑内或者体外培养的细胞内GSK-3β，可显著诱导Tau蛋白多个位点的过度磷酸化[20]。这些研究表明，细胞内的神经纤维缠结与PP2A活性降低和GSK-3β的高水平存在密切相关[21-22]。因此，PP2A和GSK-3β可能参与促进Tau在阿尔茨海默病患者大脑中的聚集。

本研究发现，黑逍遥散干预后，阿尔茨海默病模型大鼠学习能力和记忆障碍得到改善，轴突棘数量增加，血清及海马PP2A水平升高，GSK-3β、Tau水平降低，并以高剂量组最为显著，说明黑逍遥散可能通过调节阿尔茨海默病大鼠体内PP2A、GSK-3β水平，减少Tau过度磷酸化，进而改善大鼠学习记忆能力，发挥抗阿尔茨海默病的作用。此外，与空白组比较，假手术组大鼠第5天逃避潜伏期延长，海马CA1区树突棘密度减少，海马中Tau水平升高，其他指标未见明显变化，提示手术创伤对大鼠认知能力和神经元的改变会产生一定影响，但还需要确切证据来证明。