不同粒度熟大黄粉体学性质及5种游离蒽醌溶出度研究

杨 菲， 常金花， 薛禾菲， 王雨欣， 刘翠哲

(承德医学院中药研究所，河北 承德 067000)

大黄性味苦寒，具有泻热通肠、凉血解毒、逐瘀通经等功效，其有效成分主要为蒽醌类，包括大黄酸、大黄素、大黄酚、芦荟大黄素、大黄素甲醚等[1-3]。大黄炮制后，活性成分会发生明显的改变[4-5]，从而导致功效显著不同，其中熟大黄经炮制泻下作用相对温和，同时也具有活血化瘀、清热解毒的功效，被卫生部列为可用于保健食品物品名单。

超微粉碎技术是一种物料加工新技术，目前已广泛应用于中药粉碎[6-7]。研究表明，随着粒径减小，比表面积增大，粉体流动性、收率降低，吸湿性及有效成分溶出速率、溶出量、相对累积溶出比率升高[8]，故以中药材经超微粉碎后可改善其加工性能，加快有效成分溶出，提高生物利用度和利用率[9-11]。现有文献对不同粒度大黄在单一溶出介质中的溶出度有所研究，但尚未报道不同粒度炮制品在不同溶出介质中的溶出情况。因此，本实验对不同粒度熟大黄粉体学性质及其有效成分在4种溶出介质中的溶出情况进行研究，可为其超微粉体的应用提供依据。

1 材料

1.1 仪器 BFM-6A研磨混炼机(上海人民企业集团有限公司)；XA-1固体样本粉碎机(常州越新仪器制造有限公司)；Bettersize2600激光粒度分布仪(丹东百特仪器有限公司)；RC806溶出试验仪(天津市天大天发科技有限公司)；Agilent 1260高效液相色谱仪(美国Agilent公司)；JA2003上皿电子天平(上海精科实业有限公司)；Cubis MSE125P天平(江苏科析仪器有限公司)；ZNHW智能恒温电热套(巩义市予华仪器有限责任公司)；标准筛(上虞市五星冲压筛具厂)。

1.2 试剂与药物 熟大黄购自北京同仁堂大药房，批号640200401，经承德医学院中药研究所苏占辉老师鉴定为蓼科植物掌叶大黄RheumpalmatumL.的干燥根及根茎。芦荟大黄素(批号110795-201710)、大黄酸(批号110757-201607)、大黄素(批号110756-201512)、大黄素甲醚(批号110758-201616)对照品均购自中国食品药品检定研究院；大黄酚对照品(批号20160316)购自坛墨质检标准物质中心。十二烷基硫酸钠(天津百伦斯生物技术有限公司)；磷酸二氢钠(天津市北方天医化学试剂厂)；磷酸、甲醇为色谱纯(北京迈瑞达科技有限公司)；水为纯净水(天津娃哈哈食品有限公司)。

2 方法与结果

2.1 粉体制备 取适量饮片放入粉碎机中粉碎，过筛，得细粉；另取适量饮片放入研磨混炼机中分别粉碎1、4 min，得微粉Ⅰ、微粉Ⅱ。

2.2 粒径、比表面积测定 设定参数为进料速度7，料斗高度1.1 mm，气压强度0.2 MPa。取“2.1”项下细粉、微粉Ⅰ、微粉Ⅱ适量，采用激光粒度分布仪(干法)分别测定6次，取平均值，结果见表1，可知粒径、比表面积RSD分别为1.09%、0.77%，符合相关要求。

表1 粉体粒径、比表面积测定结果

2.3 堆密度、休止角测定

2.3.1 堆密度 取“2.1”项下细粉、微粉Ⅰ、微粉Ⅱ适量，质量分别为m1、m2、m3，轻轻倒入100 mL量筒中，设置下落高度为2 cm，振动100次，测定体积V，计算堆密度ρ0，公式为ρ0=m/V，平行6次，取平均值，结果见表2，可知堆密度RSD为1.51%，符合相关要求。

表2 粉体休止角、堆密度测定结果

2.3.2 休止角

将2个玻璃漏斗一上一下固定于铁架台上，从其最底端到绘图纸的距离设为H，取“2.1”项下细粉、微粉Ⅰ、微粉Ⅱ适量，使其通过玻璃漏斗自由落在绘图纸上，直到堆成最大直径的圆锥体为止，测量直径D，计算休止角，平行6次，取平均值，结果见表2，可知休止角RSD为3.36%，符合相关要求。

一般认为，休止角≤30°表示流动性好，>30°且≤40°可满足生产过程中流动性需求，>40°表示流动性差[12]。表2显示，随着粒径减小，堆密度、休止角升高，流动性减小，其中微粉Ⅰ、Ⅱ休止角>40°，表示两者流动性较差。

2.4 游离蒽醌含量测定

2.4.1 色谱条件 Agilent C18色谱柱(250 mm× 4.6 mm,5 μm)；流动相甲醇-0.1%磷酸(85∶15)；体积流量1.0 mL/min；柱温30 ℃；检测波长254 nm；进样量10 μL。

2.4.2 溶液制备

2.4.2.1 对照品溶液 精密称取对照品芦荟大黄素10.12 mg、大黄酸10.12 mg、大黄素10.18 mg、大黄酚10.17 mg、大黄素甲醚5.09 mg，置于100 mL量瓶中，甲醇超声溶解，放冷至室温，甲醇定容至刻度，得贮备液，分别精密量取1.6 mL，置于10 mL量瓶中，甲醇超声混匀，定容至刻度，得到五者质量浓度分别为16.19、16.19、16.29、16.27、8.14 mg/L的溶液，即得。

2.4.2.2 供试品溶液 取“2.1”项下细粉、微粉Ⅰ、微粉Ⅱ各约0.5 g，精密称定，置于具塞平底烧瓶中，精密加入甲醇25 mL，称定质量，加热回流1 h，放冷，甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.4.3 线性关系考察 精密称取对照品芦荟大黄素4.02 mg、大黄酸4.15 mg、大黄素4.02 mg、大黄酚10.11 mg、大黄素甲醚4.06 mg，混合，甲醇定容至50 mL量瓶内，制成5个质量浓度的溶液，分别精密吸取10 μL，在“2.4.1”项色谱条件下进样测定。以对照品质量浓度为横坐标(X)，峰面积为纵坐标(Y)进行回归，得方程为芦荟大黄素Y=45.991X+130.41(r=0.999 0)，线性范围2.51～80.4 μg/mL；大黄酸Y=37.168X-51.291(r=0.999 5)，线性范围1.30～83 μg/mL；大黄素Y=35.401X+116.09(r=0.999 2)，线性范围1.26～80.4 μg/mL；大黄酚Y=50.409X+411.11(r=0.999 1)，线性范围3.16～202.2 μg/mL；大黄素甲醚Y=23.116X+58.607(r=0.999 4)，线性范围1.27～81.2 μg/mL。

2.4.4 专属性试验 取对照品、供试品溶液，在“2.4.1”项色谱条件下进样测定，结果见图1。由此可知，各成分色谱峰分离度理想，表明该方法专属性良好。

2.4.5 精密度试验 取同一份对照品溶液，在“2.4.1”项色谱条件下进样测定6次，测得芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚峰面积RSD分别为0.12%、0.12%、0.14%、0.69%、0.20%，表明仪器精密度良好。

2.4.6 稳定性实验 取微粉Ⅱ适量，于0、4、8、12、16、20、24 h在“2.4.1”项色谱条件下进样测定，测得芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚峰面积RSD分别为1.9%、2.5%、0.6%、0.5%、2.1%，表明溶液在24 h内稳定性良好。

2.4.7 重复性试验 取微粉Ⅱ适量，按“2.4.2.2”项下方法平行制备6份供试品溶液，在“2.4.1”项色谱条件下进样测定，测得芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚含量RSD分别为0.33%、1.00%、0.25%、0.44%、0.75%，表明该方法重复性良好。

2.4.8 加样回收率试验 取“2.1”项下细粉、微粉Ⅰ、微粉Ⅱ适量，加入对照品溶液，按“2.4.2.2”项下方法平行制备6份供试品溶液，在“2.4.1”项色谱条件下进样测定，计算回收率。结果，芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚平均加样回收率分别为99.41%、98.91%、98.45%、99.91%、98.70%，RSD分别为0.83%、1.40%、1.10%、0.59%、0.83%。

2.4.9 样品含量测定 取“2.1”项下细粉、微粉Ⅰ、微粉Ⅱ适量，按“2.4.2.2”项下方法平行制备6份供试品溶液，在“2.4.1”项色谱条件下进样测定，计算含量，结果见表3。

表3 各游离蒽醌含量测定结果(%，n=6)

2.5 粉体溶出度研究

2.5.1 溶出介质制备

2.5.1.1 水 取蒸馏水900 mL，加入3.6 g SDS，即得。

2.5.1.2 人工胃液 取8.1 mL盐酸，加到900 mL蒸馏水中，37 ℃水浴保温至完全溶解，加入3.6 g SDS，即得(pH=1.2)。

2.5.1.3 人工小肠液 称取磷酸二氢钠7.0 g、SDS 3.6 g，加到900 mL蒸馏水中，37 ℃水浴保温至完全溶解，1 mol/L氢氧化钠溶液调pH至6.8，即得。

2.5.1.4 人工结肠液 称取磷酸二氢钠7.0 g、SDS 3.6 g，加到900 mL蒸馏水中，37 ℃水浴保温至完全溶解，1 mol/L氢氧化钠溶液调pH至7.4，即得。

2.5.2 测定方法 按照2020年版《中国药典》四部通则(0931)第二法(桨法)。取溶出介质900 mL，设定转速为100 r/min，温度为37 ℃，取粉体约400 mg，精密称定，置于有4号胶囊壳的溶出杯中，溶出介质水、人工胃液取样时间为15、30、60、90、120 min，人工小肠、人工结肠液为15、30、60、90、120、180、240 min，分别取样5 mL，等量介质补足，0.45 μm微孔滤膜过滤，取续滤液，在“2.4.1”项色谱条件下进样测定，计算溶出度，公式为溶出度=(某时间点成分溶出量/成分初始含量)×100%，绘制溶出曲线，见图2～6。由此可知，微粉Ⅱ的溶出度最高，各游离蒽醌在不同溶出介质中的溶出度分别为芦荟大黄素，人工小肠液>水>人工结肠液>人工胃液；大黄酸，水>人工结肠液>人工小肠液>人工胃液；大黄素，人工结肠液>人工小肠液>水>人工胃液；大黄酚，人工结肠液≈人工小肠液>水>人工胃液；大黄素甲醚，人工结肠液>水>人工小肠液>人工胃液。

3 讨论

研究表明，超微粉碎后会使粉体粒径变小，粒子间相互作用力变大，粘附性增强，显示出较差的流动性。本实验结果显示，随着熟大黄粉体粒径的减小，流动性也会降低，其中细粉流动性最好，而经超微粉碎后微粉Ⅰ与微粉Ⅱ流动性较差，与前期研究结果一致。

由于量子尺寸和表面效应，粉体的细化会使中药材粉体呈现新的粉体学特性，如良好的溶解性、分散性，从而增加生物利用度[13]。同时，根据Noyes-Whitney方程可知粉体的比表面积和溶解度，都与溶出速率成正比，即比表面积越大，溶解度越高，其溶出度就越好。本研究也发现，随着熟大黄粉体粒度减小，5种游离蒽醌溶出度逐渐增高，表明超微粉碎技术可促进上述有效成分的溶出。

本实验研究了熟大黄粉体在不同pH值溶出介质中的溶出度，发现在人工胃液中最小。研究证实，弱碱对大黄中游离蒽醌的提取率优于甲醇，大黄游离蒽醌较易溶于弱碱中[14]，而且该类成分在胃液中的稳定性较差[15]。此外，微粉Ⅰ中5种游离蒽醌在人工胃液中的溶出曲线呈先增后减的趋势，可能是溶出过程中蒽醌类成分达到超饱和状态。

综上所述，经过超微粉碎后熟大黄有效成分溶出度增加，而且5种游离蒽醌均在下消化道的溶出效果最好，这为该药材制成肠溶制剂后增加泻下作用提供了实验依据，也为相关保健品开发提供了理论基础。