HPLC-CAD指纹图谱结合化学计量学评价不同产地黄芪质量

姚 静， 杨晓宁*， 朱 平， 张 超， 王玉龙， 孙欣光*

(1.北京振东光明药物研究院有限公司，北京 100085；2.山西振东道地药材开发有限公司，山西 长治 047100)

中药所含成分复杂、结构多样，具有多组分、多靶点的特点[1-3]。中药指纹图谱通过对中药化学成分轮廓进行描述，可整体、宏观地进行质量控制，能较全面地反映其种类及数量，是具有系统性、特征性的一种方法[4-7]。

黄芪始载于《神农本草经》，列为上品，为豆科黄芪属植物蒙古黄芪Astragalusmembranaceus(Fisch.)Bge.var.ongholicus(Bge.)Hsiao 或膜荚黄芪Astragalusmembranaceus(Fisch.)Bge.的干燥根，具有补气升阳、固表止汗、利水消肿等功效[8]，主要含有皂苷、黄酮、多糖等成分，具有增强机体免疫力、抗病毒、抗心脑损伤等药理活性[9-11]，药用历史悠久，临床应用广泛，市场需求大，种植广泛,并且不同产地黄芪中黄酮、皂苷等6种成分含量具有一定差异[12]。

目前，国内外对黄芪指纹图谱已有较多报道[13-18]，大多采用高效液相串联紫外检测器(HPLC-UV)[15]、高效液相串联蒸发光散射检测器(HPLC-ELSD)[17,19]，少数采用液相色谱串联质谱(LC-MS)[16]，但皂苷采用HPLC-UV分析时很难达到理想的响应和检测，而HPLC-ELSD灵敏度较低，都不能全面表征该药材所含成分的整体性。电雾式检测器(CAD)作为通用型检测器，其响应不依赖于化合物的分子结构，灵敏度比HPLC-ELSD更高，尤其适于紫外吸收较弱的皂苷等成分[12]。因此，本实验建立黄芪HPLC-CAD指纹图谱结合化学计量学，分析不同产地药材质量差异，以期其质量评价提供科学依据。

1 材料

U3000高效液相色谱仪(美国赛默飞公司，配置LPG-3400SD泵、WPS-3000TRS自动进样器、TCC-3200柱温箱、Corona Veo RS电雾式检测器)；Agilent 385-ELSD型蒸发光散射检测器、Agilent 1260 VWD紫外检测器(美国安捷伦公司)；XSE205DU电子分析天平(瑞士Mettler-Toledo公司)；KQ-500DE型数控超声清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；Milli-Q纯水机(美国Millipore公司)。

毛蕊异黄酮葡萄糖苷(批号111920-201606，纯度97.6%)、黄芪甲苷(批号110781-201717，纯度96.9%)、芒柄花素(批号3523，纯度98.2%)、黄芪皂苷Ⅰ(批号6107，纯度99.0%)、黄芪皂苷Ⅱ(批号3258，纯度100.0%)对照品(上海诗丹德生物技术有限公司)；7,2′-二羟基-3′,4′-二甲氧基异黄烷(批号Y31D10H107318，纯度98%)、美的紫檀苷(批号P21N9F75533，纯度98%)、黄芪异黄烷苷(批号P31D10F107320，纯度98%)对照品(上海源叶生物科技有限公司)；芒柄花苷(批号PS000671，纯度98%)、异黄芪皂苷Ⅰ(批号PS020461，纯度98%)对照品(成都普斯生物科技有限公司)。甲酸为色谱纯(批号190284，美国赛默飞公司)；乙腈、甲醇为色谱纯(德国默克公司)；其他试剂均为分析纯。

25批黄芪(编号S1～S25)具体信息见表1，经山西医科大学高建平教授鉴定为蒙古黄芪Astragalusmembranaceus(Fisch.)Bge.var.mongholicus(Bge.)Hsiao的干燥根。

表1 样品信息

2 方法

2.1 溶液制备

2.1.1 对照品溶液 精密称取毛蕊异黄酮葡萄糖苷、黄芪甲苷、芒柄花素、黄芪皂苷I、黄芪皂苷Ⅱ、7,2′-二羟基-3′,4′-二甲氧基异黄烷、美的紫檀苷、黄芪异黄烷苷、芒柄花苷、异黄芪皂苷Ⅰ对照品适量，80%甲醇制成每1 mL含上述成分各约0.1 mg的溶液，摇匀，微孔滤膜过滤，即得。

2.1.2 供试品溶液 精密称取药材粉末2 g(过4号筛)，置于100 mL圆底烧瓶中，加入80%甲醇50 mL，加热回流2 h，滤过，滤渣以20 mL甲醇洗涤，回收甲醇，蒸干，残渣以5 mL纯水复溶，加入已处理好的SP825柱上，用纯水、甲醇各60 mL洗脱，分别收集洗脱液，蒸干，甲醇洗脱部位用80%甲醇溶解并定容至5 mL量瓶中，摇匀，0.22 μm微孔滤膜过滤，取续滤液，即得。

2.2 色谱条件 Agilent SB-C18色谱柱(150 mm×4.6 mm，3.5 μm)；流动相乙腈(A)-0.1%甲酸(B)，梯度洗脱(0～3 min，15%A；3～5 min，15%～17%A；5～8 min，17%～20%A；8～25 min，20%～43%A；25～35 min，43%～60% A；35～45 min，60%～98% A；45～55 min，98% A)；体积流量1.5 mL/min；柱温40 ℃；进样量10 μL；紫外检测波长254 nm；蒸发光散射检测器，漂移管温度70 ℃，载气体积流量1.5 L/min；Corona Ultra电雾式检测器，雾化器氮气，雾化室温度50 ℃。

2.3 方法学考察

2.3.1 精密度试验 取同一份供试品溶液，在“2.2”项色谱条件下进样测定6次，测得各共有峰相对保留时间、相对峰面积RSD分别为0.02%～0.96%、1.43%～4.97%，说明各主要色谱峰保留时间与峰面积基本一致，表明仪器精密度良好。

2.3.2 重复性试验 取同一批药材，按“2.1.2”项下方法平行制备6份供试品溶液，在“2.2”项色谱条件下进样测定，测得各共有峰相对保留时间、相对峰面积RSD分别为0.02%～0.23%、1.81%～4.94%，表明该方法重复性良好。

2.3.3 稳定性试验 取同一份供试品溶液，于0、4、8、12、24、36 h在“2.2”项色谱条件下进样测定，测得各共有峰相对保留时间、相对峰面积RSD分别为0.02%～0.57%、1.28%～3.95%，表明溶液在36 h内稳定性良好。

2.4 HPLC-CAD指纹图谱建立 将25批样品色谱图导入2012年《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》软件，以S1为参照图谱，经多点校正匹配生成共有模式，见图1，发现有20个共有峰，通过与对照品比对后鉴定出10个，其中14号峰(黄芪皂苷Ⅰ)峰形良好，峰面积稳定，分离度理想，而且为主要药理活性成分，故选择其作为参照峰(S)。再测定相似度，结果见表2，可知均大于0.83，表明药材质量相对稳定，不同产地之间一致性较好。

表2 25批样品相似度

2.5 化学计量学研究

2.5.1 聚类分析 将20个共有峰峰面积导入SPSS 22.0软件进行聚类分析，结果见图2～3。由此可知，各批样品可聚为3类，第1类为内蒙古产的7批(S19～S25)，相似度0.931～0.979；第2类为山西产的8批(S11～S18)，相似度0.833～0.942；第3类为甘肃产的10批(S1～S10)，相似度0.914～0.977，表明HPLC-CAD指纹图谱与产地具有较好的相关性，而且不同产地可被有效地区分开[14,16]。

2.5.2 主成分分析(PCA)、偏最小二乘法-判别分析(PLS-DA)将20个共有峰峰面导入统计软件Ezinfo，得到PCA、PLS-DA得分分布图，见图4。

由此可知，25批样品可分为3类，第1类为内蒙古产的7批(S19～S25)，第2类为山西产的8批，第3类为甘肃产的10批(S1～S10)；甘肃、内蒙产样品分布比较靠近，而山西产样品分布比较分散，可能是由于种植方式不同所致[20-21]；变量重要性投影值(VIP值)大于1的共有峰有10个，分别为1(毛蕊异黄酮葡萄糖苷)、17、18、13(黄芪皂苷Ⅱ)、4(美的紫檀苷)、11(芒柄花素)、9、3(芒柄花苷)、5(黄芪异黄烷苷)、2号色谱峰，其相对峰面积见图5，可作为差异标志物。

3 讨论与结论

本实验建立了黄芪HPLC-CAD指纹图谱，与HPLC-ELSD、HPLC-UV相比具有更高的灵敏度和重复性，能表征出更多的色谱峰信息，更适用于该药材中无紫外吸收化合物的检测，并且HPLC-CAD检测器中色谱峰峰面积与含量呈正比，可反映各成分含量占比[22]。通过与对照品进行比对，共指认出10种成分，包括6种黄酮、4种皂苷，均为黄芪入血成分[23-24]，前者具有抗炎、抗氧化、抗菌等功效[25-27]，后者具有免疫调节、抗病毒、神经保护等活性[28-30]。

结果显示，不同产地黄芪化学成分存在差异[16]，山西产样品中毛蕊异黄酮葡萄糖苷含量显著高于甘肃、内蒙产样品中，而黄芪皂苷含量与甘肃产样品中相近，显著高于内蒙产样品中[12]；25批样品中成分种类基本一致，但其相对含量存在差异；黄芪HPLC-CAD指纹图谱与产地具有较好的相关性；10种成分可作为区分不同产地黄芪的差异标志物。

综上所述，HPLC-CAD指纹图谱结合化学计量学操作简便，专属性强，灵敏度高，重复性好，能有效分析不同产地黄芪质量的差异性，可为该药材质量评价及临床使用提供参考。