东北林蛙皮糖胺聚糖分析及其体外免疫活性

于 奇郑冉张怡李波刘达 李宜平 焦丽丽

（1.长春中医药大学药学院， 吉林 长春130117； 2.长春中医药大学吉林省人参科学研究院， 吉林 长春130117）

东北林蛙Rana dybowskiiGuenther 为蛙科林蛙属两栖动物，俗称“哈士蟆”［1］，广泛分布于黑龙江、吉林、辽宁、内蒙古等地区，主产于长白山区域，是我国著名的药食两用药材［2］。东北蛙皮中具有一定量的糖胺聚糖，在抗氧化［3］、抗凝血［4］、抗肿瘤［5］及免疫调节［6］方面呈现出较强的生物活性。近年来，许多国内外学者对林蛙皮多糖的研究主要集中在提取、分离纯化及抗氧化［7⁃9］活性等方面，但对其结构特征仍不清楚。基于此，本研究以东北林蛙皮为原料，采用水提醇沉法分离纯化得到林蛙皮多糖DGP 和DGPA，初步分析两者基础结构，并对其体外免疫活性进行研究，以期为进一步研究该成分结构及构效关系奠定基础。

1 材料

1.1 试剂、药物与动物 东北林蛙皮采自吉林省舒兰市上营森林经营局桃园林场（东经127°25′36.18＂，北纬44°09′41.7＂，海拔338 m），经长春中医药大学李宜平教授鉴定为东北林蛙Rana dybowskiiGuenther 的干燥皮肤。8～10周龄ICR 雄性小鼠，体质量（20.0±2.0）g，购自长春市亿斯实验动物技术有限责任公司，实验动物生产许可证号SCXK（辽）2020⁃0001，在相对湿度40%～60%，温度22～25 ℃的无菌动物房中适应性喂养1 周。研究获长春中医药大学伦理委员会批准，实验操作严格执行国际动物实验方针。SepharoseTMCL⁃6B 凝胶柱购自美国GE Healthcare 公司。标准分子量葡聚糖、单糖对照品购自上海源叶生物科技有限公司；考马斯亮蓝试剂盒购自南京建成生物工程研究所；1640 培养基购自美国Gibco 公司；新生牛血清购自浙江天杭生物科技股份有限公司；脂多糖（LPS）、半刀豆蛋白（ConA）、青霉素、链霉素、二甲基亚砜、MTT 均购自美国Sigma 公司。无水乙醇、氢氧化钠、三氟乙酸、三氯甲烷、正丁醇、氨基磺酸、盐酸、苯酚、硫酸等试剂均购自国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器 Model 680 型酶标仪购自美国Bio⁃Rad 公司；真空干燥箱购自上海精宏实验设备有限公司；恒温磁力搅拌器购自杭州仪表电机有限公司；离心机购自美国Sigma 公司；循环水式真空泵购自郑州长城科工贸有限公司；二氧化碳培养箱购自日本Sanyo 公司；UV⁃8000 型紫外分光光度计购自上海元析仪器有限公司；傅里叶红外光谱仪购自美国Thermo Fisher Scientific 公司。

2 方法

2.1 多糖制备 林蛙皮经水提［10］、醇沉后得粗多糖DGP，采用Sevage 法［7］脱蛋白后进一步用Sepharose CL⁃6B 琼脂糖凝胶柱层析，得纯化后多糖DGPA。

2.2 多糖理化性质分析 采用考马斯亮蓝法、间羟基联苯法对DGP、DGPA 总蛋白及糖醛酸水平进行检测。

2.3 多糖分子量测定 参考文献［6］ 报道，色谱条件为TSKgel G3000 PWXL 色谱柱（7.8 mm×30.0 cm，5 μm）；流动相超纯水；体积流量0.5 mL／min；柱温40 ℃；进样量20 μL。采用视差折射检测器，用流动相配制不同分子量对照品溶液，多糖配制为10 mg／mL 溶液，0.22 μm 微孔滤膜过滤。

2.4 多糖傅里叶变换红外光谱分析 2～3 mg 多糖与适量KBr 混合研细后压片，在4 000～500 cm－1波数范围内进行红外光谱扫描。

2.5 单糖组成分析 多糖经三氟乙酸（TFA）水解后进行PMP 衍生。参考文献［11］ 报道，色谱条件为C18Thermo hyperil ODS⁃2 色谱柱（4.6 mm×25 cm，5 μm）；流动相17%乙腈⁃83% PBS；体积流量1 mL／min；柱温25 ℃；进样量20 μL；检测波长245 nm。

2.6 体外免疫活性检测

2.6.1 多糖对小鼠淋巴细胞增殖转化的影响 小鼠脱颈处死，无菌条件下解剖并取出脾脏，研磨制成脾细胞悬液，1 500 r／min离心5 min，弃上清，Tris⁃NH4Cl 低渗液裂解红细胞，离心，D⁃Hanks 缓冲液洗涤，培养液将细胞密度稀释至1×106／mL，制成单细胞悬液［12］，加入细胞培养板中，每孔100 μL，随机分为空白 组、ConA 组（5 μg／mL ConA）、LPS 组（10 μg／mL LPS）、DGP 组（50、100、200、400 μg／mL 多糖溶 液）、DGPA 组（50、100、200、400 μg／mL 糖胺聚糖溶液）、阳性对照组（5 μg／mL ConA或10 μg／mL LPS），培养液补至200 μL，混匀，重复3孔，在5% CO2、37 ℃条件下培养44 h后，每孔加入20 μL MTT（5 mg／mL），继续培养4 h，弃上清，加入150 μL 二甲基亚砜，于570 nm 波长处测定吸光度。

2.6.2 多糖对腹腔巨噬细胞的影响 小鼠腹腔注射6%可溶性淀粉2 mL，3 d 后处死，10 mL D⁃Hanks 缓冲液清洗腹腔，收集液体，4 ℃离心后弃上清，1640 完全培养基重悬细胞，调整细胞密度为2×106／mL，取100 μL 接种至96 孔板，在5% CO2、37 ℃下预孵3 h，PBS 清洗2～3次，除去贴壁细胞，制得纯化巨噬细胞。

2.6.2.1 多糖对腹腔巨噬细胞吞噬功能的影响 将纯化后的巨噬细胞加到待测糖样（200 μL／孔）中，继续培养24 h后吸弃上清，每孔加入100 μL 0.075%中性红溶液继续培养1 h，pH 7.4 PBS 洗去剩余中性红后，加入100 μL 细胞裂解液，24 h 后采用酶标仪于550 nm 波长处检测吸光度。

2.6.2.2 多糖对腹腔巨噬细胞NO 水平的影响 配制6 个不同浓度的NaNO2溶液，分别加到96 孔板中，加入等体积Griess 试剂，10 min 后于540 nm 波长处检测吸光度，绘制标准曲线。细胞以2×106／mL 密度接种至24 孔板，加入多糖培养24 h，吸取细胞培养液上清100 μL 加到另一培养板中，加入等体积Griess 试剂，10 min 后在540 nm 波长处测定吸光度，根据标准曲线计算NO 水平。

2.6.2.3 TNF⁃α 水平检测 腹腔巨噬细胞与多糖一起培养，取上清液，采用ELISA 试剂盒检测细胞上清TNF⁃α水平。

2.7 统计学分析 通过SPSS 23.0 软件进行处理，结果以（）表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用t检验。P＜0.05 表示差异具有统计学意义。

3 结果

3.1 糖胺聚糖柱层析纯化 图1 显示，DGP 过SepharoseTMCL⁃6B 柱后得到单一、对称的洗脱峰，收集相应多糖洗脱液，即为糖胺聚糖DGPA。

图1 糖胺聚糖DGPA SepharoseTMCL⁃6B 柱层析

3.2 多糖理化性质 DGP、DGPA 总蛋白质量分数分别为19.93%、6.24%。采用间羟基联苯法，以D⁃半乳糖醛酸含量为横坐标（X），吸光度为纵坐标（A）进行回归，得方程为A＝0.010 7X＋0.059 2（R2＝0.998 3），DGP、DGPA糖醛酸质量分数分别为14.5%、18.6%。DGPA 经高效凝胶渗透色谱法分析，以保留时间为横坐标（X），标准分子量为纵坐标（Y）进行回归，得方程为Y＝－0.354 1X＋9.392 7（R2＝0.996 7），测得DGPA 分子量为141 kDa。

3.3 单糖组成 图2～3 显示，DGP、DGPA 单糖组成相同，均由甘露糖、葡萄糖醛酸、葡萄糖、氨基半乳糖、半乳糖组成，前者摩尔比为0.30∶2.05∶0.17∶1∶0.23，以葡萄糖醛酸、氨基半乳糖为主，表达为81.3%；后者摩尔比为0.41∶2.67∶0.16∶1∶0.25，以糖醛酸为主，表达为59.4%。

图2 DGP 单糖HPLC 色谱图

3.4 多糖红外光谱分析 图4 显示，3 370.38 cm－1左右的吸收峰为糖类⁃OH 的特征吸收峰，2 936.27 cm－1处的吸收峰为C⁃H 键强伸缩振动，1 653.10、1 544.57 cm－1左右的吸收峰说明有乙酰氨基（⁃NH2COCH3）存在，1 408.12 cm－1处的吸收峰为⁃COO－的特征吸收峰。综上所述，⁃OH、⁃C⁃H链、⁃NH2COCH3、⁃COO 是糖的特征基团，故DGPA 为糖胺聚糖。

图3 DGPA 单糖HPLC 色谱图

图4 DGPA 红外光谱图

3.5 多糖对小鼠脾淋巴细胞增殖的影响 图5 显示，与空白组比较，DGP 组、DGPA 组小鼠淋巴细胞增殖能力增强（P＜0.05，P＜0.01），并均呈剂量依赖性；与DGP 组比较，DGPA 组小鼠淋巴细胞增殖能力增强（P＜0.05，P＜0.01）。图6～7 显示，在50～400 μg／mL 质量浓度范围内，DGP组、DGPA 组协同ConA 作用小鼠脾淋巴细胞时，细胞增殖能力高于ConA 组（P＜0.01），表明两者均能促进诱导ConA 诱导的T 淋巴细胞增殖，并呈剂量依赖性，在400 μg／mL时作用最强，为空白组的3～4 倍；在50～100 μg／mL质量浓度范围内，DGP 组、DGPA 组协同LPS作用于小鼠脾淋巴细胞时，细胞增殖能力低于LPS 组（P＜0.05），表明两者均能抑制LPS 诱导B 淋巴细胞增殖；在200～400 μg／mL 质量浓度范围内，细胞增殖能力高于LPS组（P＜0.01），表明两者促进LPS 诱导B 淋巴细胞增殖，并且在相同质量浓度下DGPA 组作用更优。

图5 多糖对小鼠脾淋巴细胞增殖的影响（，n＝10）

图6 多糖对ConA 诱导小鼠脾淋巴细胞增殖的影响（，n＝10）

3.6 多糖对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能的影响 巨噬细胞的主要功能是吞噬病原体等异物［13］。图8 显示，与空白组比较，DGPA 组小鼠巨噬细胞吞噬功能增强（P＜0.05，P＜0.01），并呈剂量依赖性；当质量浓度为400 μg／mL时，DGP 组、DGPA 组均能增强小鼠巨噬细胞吞噬功能，效果分别为空白组的1.25、2 倍。

图7 多糖对LPS 诱导小鼠脾淋巴细胞增殖的影响（，n＝10）

图8 多糖对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能的影响（，n＝10）

3.7 多糖对小鼠腹腔巨噬细胞NO 水平的影响 图9 显示，与空白组比较，DGPA 组小鼠巨噬细胞NO 水平升高（P＜0.05，P＜0.01），并呈剂量依赖性；当质量浓度为400 μg／mL时，DGP 组、DGPA 组均能增强小鼠巨噬细胞产生NO 的能力，效果分别为空白组的3、5 倍。

图9 多糖对小鼠腹腔巨噬细胞NO 水平的影响（，n＝10）

3.8 多糖对小鼠巨噬细胞TNF⁃α 水平的影响 图10 显示，在100～400 μg／mL 质量浓度范围内，DGPA 组能增强小鼠巨噬细胞分泌细胞因子TNF⁃α 能力（P＜0.05，P＜0.01），并呈剂量依赖性；当质量浓度大于100 μg／mL时，DGPA组增强小鼠巨噬细胞分泌TNF⁃α 的能力大于DGP 组（P＜0.05）。

图10 多糖对小鼠腹腔巨噬细胞TNF⁃α 水平的影响（，n＝10）

4 讨论

通过对分子量、单糖组成、特殊基团的研究，确定了DGPA 为糖胺聚糖类化合物。已有研究表明，糖胺聚糖类化合物等具有显著的免疫调节作用，其功能与结构密切相关［14］，杨洁［15］发现仿刺参糖胺聚糖能促进DC 细胞的增殖和细胞因子IL⁃12、TNF⁃α 的分泌。多种糖胺聚糖，例如仿刺参糖胺聚糖［12］、菲律宾蛤仔糖胺聚糖［16］、珠贝母糖胺聚糖［17］、近江牡蛎糖胺聚糖［14］等均被证明具有显著的有免疫活性。本研究发现，林蛙皮糖胺聚糖具有显著的免疫调节作用，且纯化后的林蛙皮多糖DGPA 对淋巴细胞和巨噬细胞的激活作用明显优于粗多糖DGP，而这2 种多糖的单糖组成存在一定差异，尤其是纯化后多糖DGPA 的氨基半乳糖和葡萄糖醛酸的相对水平高于粗多糖DGP，而单糖组成是影响多糖活性的重要因素。因此，林蛙皮多糖DGPA 组与DGP 组的免疫活性差异可能与其单糖组成的差异有关，具体影响机制有待进一步研究。