龙胆泻肝丸（片）中当归掺伪情况研究

余荣兰 杨建冬 袁秀泽 邓杰华 黄招光 周云峰∗

（1.淳安县第一人民医院， 浙江 杭州311700； 2.宜春市食品药品检验所， 江西 宜春336000）

当归为伞形科植物当归Angelica sinensis（Oliv.）Diels的干燥根［1］，具有补血活血、调经止痛、润肠通便等功效［2⁃4］。当归属于食药同源药材，需求量大［5］，近年来，随着野生资源日益枯竭，当归市场价格水涨船高，出现了各种混淆品和伪品［6⁃8］，其中在当归中掺入价格较为低廉的独活栽培品较为常见。独活为伞形科植物重齿毛当归Angelica pubescensMaxim.F.biserrata Shan et Yuan 的干燥根，具有祛风除湿、通痹止痛的功效，其与当归同属伞形科，外观性状差异小，但临床功效有较大区别，不可混用。

龙胆泻肝丸（片）是由多种药味组成的复方制剂［9⁃10］，具有清肝胆、利湿热的功效，方中含有当归。鉴于市场上有独活混淆品出现，其有可能会带入以当归为药味的中药复方制剂中，有必要开展龙胆泻肝制剂中独活筛查的探索性研究。当归主要含藁本内酯、阿魏酸、洋川芎内酯I等［11］，独活含有蛇床子素、二氢欧山芹醇当归酸酯、二氢欧山芹醇等成分［12］。蛇床子素和二氢欧山芹醇当归酸酯是独活的定量特征成分，基于此，本研究建立可测定蛇床子素和二氢欧山芹醇当归酸酯的超高效液相色谱串联质谱法（UPLC⁃MS／MS），筛查龙胆泻肝丸（片）中当归原料是否掺杂独活，为龙胆泻肝制剂整体质量的控制提供科学依据。

1 材料

H⁃class／xevo 超高效液相色谱⁃三重四极杆质谱仪（美国Waters 公司）；PL⁃S60 超声波清洗仪（东莞康士洁超声波科技有限公司）。蛇床子素（批号110822⁃201710，含量99.5%）、二氢欧山芹醇当归酸酯对照品（批号111583⁃201605，含 量98.6%）。当归对照药材（批号120927⁃201617）、独活对照药材（批号120940⁃201612）均购自中国食品药品检定研究院；柴胡（江西臻药堂药业股份有限公司，批号200504，产地山西）、龙胆（江西药都堂中药饮片有限公司，批号20190301，产地云南）、黄芩（江西康齐乐中药材有限公司，批号20210401，产地山西）、栀子（江西康齐乐中药材有限公司，批号20210201，产地江西）、盐泽泻（江西宝芝堂中药饮片有限公司，批号201001，产地四川）、木通（湖南省松龄堂中药饮片有限公司，批号201101，产地湖北）、车前子（樟树市庆仁中药饮片有限公司，批号201905353，产地江西）、当归（安徽百岁堂中药饮片有限公司，批号210501，产地甘肃定西）、地黄（郑州瑞龙制药股份有限公司，批号21050405，产地河南）、炙甘草（江西康齐乐中药材有限公司，批号20201101，产地甘肃），由宜春市食品药品检验所杨建冬主任中药师鉴定为正品；龙胆泻肝丸（片）共49批，均来源于零售和连锁药店，生产企业涉及26 家。实验用水为超纯水；其他试剂均为质谱级。

2 方法与结果

2.1 质谱和色谱条件 电喷雾离子源；碰撞气氩气；脱溶剂气体流量1 000 L／h；锥孔气流量50 L／h；ESI 温度150 ℃；脱溶剂气温度600 ℃；毛细管电压0.5 V；采用多反应检测（MRM）模式，正离子扫描，其他质谱参数见表1。Waters ACQUITY UPLC CSH C18色谱柱（2.1 mm ×100 mm，1.7 μm）；流动相0.1% 甲酸⁃乙腈，梯度洗脱（0～2 min，25% A；2～5 min，25%～75% A；5～8 min，75%A；8～8.5 min，75%～25% A；8.5～11 min，25% A）；体积流量0.3 mL／min；柱温30 ℃；进样量5 μL。

表1 质谱参数

2.2 溶液制备 蛇床子素对照品溶液：称取蛇床子素对照品适量，加甲醇制成每1 mL 含蛇床子素164.0 ng 的溶液，精密量取2、5、10、20、25 mL 分别置50 mL 量瓶，用甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。二氢欧山芹醇当归酸酯对照品溶液：称取二氢欧山芹醇当归酸酯对照品适量，加甲醇制成每1 mL 含二氢欧山芹醇当归酸酯99.59 ng 的溶液，再精密量取2、5、10、20、25 mL 分别置50 mL 量瓶，用甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。供试品溶液：取本品适量，片剂、水丸和浓缩丸研细，大蜜丸加等量硅藻土混匀研细，取2 g，置100 mL 量瓶中，加入甲醇约80 mL，超声处理30 min，放冷，加甲醇至刻度，摇匀，0.22 μm 微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。自制样品溶液：称处方比例（龙胆120 g、柴胡120 g、黄芩60 g、栀子60 g、泽泻120 g、木通60 g、车前子60 g、当归60 g、地黄120 g 和炙甘草60 g）自制原粉混合样品约2 g，制备样品溶液。阴性样品溶液：称取不含当归的原粉混合样品约2 g，制备阴性样品溶液。当归对照药材溶液：称取当归对照药材约2 g，制备当归对照药材溶液。独活对照药材溶液：称取独活对照药材约2 g，置100 mL 量瓶中，加入甲醇约80 mL，超声处理30 min，放冷，精密吸取续滤液0.1 mL 置100 mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，过滤，取续滤液，即得。

2.3 线性关系考察 取蛇床子素和二氢欧山芹醇当归酸酯对照品溶液分别进样测定峰面积，以对照品质量浓度为横坐标（X），以峰面积为纵坐标（Y），绘制标准曲线，见表2。结果表明，蛇床子素和二氢欧山芹醇当归酸酯在各自范围内线性关系良好。以信噪比为3∶1 时的对照品质量浓度作为仪器检测限。

表2 各成分线性关系

2.4 专属性试验 对阴性样品、对照药材、自制样品、供试品、混合对照品溶液依次测定，见图1。蛇床子素对照品保留时间约为6.85 min，二氢欧山芹醇当归酸酯对照品保留时间约为7.05 min，阴性样品、对照药材和正常样品均无色谱峰，说明样品中各药味对测定无干扰，专属性良好。

图1 各成分色谱图

2.5 精密度试验 取混合对照品溶液，连续进样6次，记录峰面积，蛇床子素峰面积RSD 为2.07%，二氢欧山芹醇当归酸酯峰面积RSD 为1.64%，表明精密度良好。

2.6 重复性试验 取同一批样品6份，每份约2 g，测定含量。蛇床子素含量RSD 为2.34%，二氢欧山芹醇当归酸酯含量RSD 为2.75%，重复性结果符合要求。

2.7 稳定性试验 取供试品溶液，在0、1、2、4、8、16 h测定峰面积。蛇床子素含量RSD 为3.16%，二氢欧山芹醇当归酸酯含量RSD 为3.74%，表明供试品溶液在16 h内稳定性良好。

2.8 加样回收率试验 取样品6份，各约1 g，置于100 mL量瓶中，精密加入混合对照品溶液（蛇床子素573.9 ng／mL、二氢欧山芹醇当归酸酯149.4 ng／mL）5 mL，测定峰面积，计算回收率，见表3。

表3 各成分加样回收率试验结果

2.9 含量测定 49 批龙胆泻肝丸（片）有3 批样品检出独活特征性成分，其中片剂2 批、丸剂1批，检出率约为6%。检出蛇床子素和二氢欧山芹醇当归酸酯的有3 批样品，计算含量，结果见表4，每批样品平行测定2 次。蛇床子素含量范围为0.005 615～2.601 μg／g，二氢欧山芹醇当归酸酯含量范围为0.038 43～0.823 2 μg／g。

表4 含量测定结果（μg／g）

3 讨论

通过质谱发现蛇床子素的主要碎片离子为245、189、159、131、103、77；二氢欧山芹醇当归酸酯的碎片离子为329、311、251、229、187、83，有3 批样品检出与各对照品相应的碎片离子。通过离子丰度比可知，样品与蛇床子素对照品的离子丰度比基本一致，而与二氢欧山芹醇当归酸酯对照品的有一定差别，但独活对照药材与样品基本相同，分析原因可能是二氢欧山芹醇当归酸酯对照品属于纯度较高的化合物，其他杂质对其无干扰，而样品中的二氢欧山芹醇当归酸酯来自独活，可能存在二氢欧山芹醇当归酸酯的立体异构体的干扰［13］，因为原化合物与立体异构体的离子丰度比会有差异［14］。蛇床子素和二氢欧山芹醇当归酸酯属于香豆素类化合物［15］，在水煎液中的转移率为2.3%～10.1%和2.3%～12.2%［16］。根据药典中独活含有蛇床子素的下限值和片剂的生产工艺可知，该样品中当归原料可能混有的独活量最高可达19%，超过杂质最大值（3%），说明该企业的当归原料可能存在问题，采用混有较多独活的当归进行投料生产。

本研究采用的HPLC⁃MS／MS 法灵敏度高、专属性强、分析速度快、样品需要量少、样品前处理简单，能够有效检出龙胆泻肝丸（片）中蛇床子素和二氢欧山芹醇当归酸酯的含量情况，筛查当归原料是否掺杂独活，为龙胆泻肝制剂整体质量的控制提供借鉴。