60 Co⁃γ 辐照对大黄化学成分及抗菌活性的影响

毛腾霄 黄晓婧黄敏陈红∗汪洋

（1.成都市药品检验研究院， 四川 成都610045； 2.四川省原子能研究院辐照保藏四川省重点实验室，四川 成都610101）

大黄是廖科植物掌叶大黄Rheum palmatumL.、唐古特大黄Rheum tanguticumMaxim.ex Balf.或药用大黄Rheum officinaleBaill.的干燥根和根茎［1］，含有多种化学成分，以蒽醌类衍生物为主。现代药理学及临床应用表明，该药材具有抗菌消炎的作用［2⁃3］。

中药材一般有一定的微生物负载，故降低菌量是药材在生产、加工过程中的重要目标之一。60Co⁃γ 灭菌法是近年流行起来的新型消毒灭菌方法，它在常温下消毒灭菌而不破坏药材中易挥发成分及热敏性物质，具有穿透力强、消毒均匀、快速等特点，目前已广泛用于中药材及其制品的灭菌［4⁃5］。目前，辐照灭菌所用剂量一般参照1997 年版《60Co 辐照中药灭菌剂量标准》和2015 年版《中药辐照灭菌技术指导原则》要求执行，前者规定中药原粉能接受的辐照剂量不得过6 kGy，后者规定中药最大总体平均辐照剂量原则上不超过10 kGy。课题组前期调研发现，在实际操作时同一次辐照可能包括几种不同的物品［6］，为了保证辐照后卫生学指标都合格，一般选择大剂量（10～15 kGy），个别品种甚至达到30 kGy，而且目前已有关于辐照引起中药化学成分变化的报道［7⁃8］。本实验模拟企业常用辐照剂量，采用HPLC 法比较辐照前后大黄总蒽醌、5种游离蒽醌（芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚）含量的变化，再以管碟法检测辐照前后对金黄色葡萄球菌的抑制作用，旨在为今后研究其他中药辐照工艺提供依据。

1 材料

1.1 药材 唐古特大黄、掌叶大黄均购自成都荷花池中药材市场，经成都市药品检验研究院中药材市场质量监测研究重点实验室鉴定为正品。

1.2 试剂与药物 芦荟大黄素（批号110795⁃201710）、大黄酸（批号110757⁃201607）、大黄素（批号110756⁃201913）、大黄酚（批号110796⁃201922）、大黄素甲醚（批号110758⁃201817）对照品及金黄色葡萄球菌［CMCC（B）26003］均由中国食品药品检定研究院提供。抗生素检定用培养基Ⅰ（含胨5 g、牛肉浸出粉3 g、磷酸氢二钾3 g、琼脂15 g、水1 000 mL，pH 7.9）、胰酪大豆胨液体培养基（批号200224⁃21）均购自北京陆桥技术股份有限公司。0.9% 无菌氯化钠溶液为自制，灭菌后备用。

1.3 仪器 Waters 2695 液相色谱仪（美国Waters 公司）；AEG 220 电子天平（日本岛津公司）；ZY⁃300Ⅳ多功能微生物自动测量分析仪（北京先驱威锋技术开发公司）。

2 方法

2.160Co⁃γ 辐照 唐古特大黄、掌叶大黄粉碎后过4 号筛，分装于无菌袋中，在四川省辐照中心进行60Co⁃γ 辐照，剂量设置为0、5、10、20、30 kGy（其中0 kGy 是未辐照处理），分别平行处理2 次。辐照完成后，立即进行各项指标检测。

2.2 总蒽醌、游离蒽醌含量测定 参照2020 年版《中国药典》“大黄”项下［9］方法处理药材，经热回流提取后过滤备用。

2.2.1 对照品溶液制备 精密称取芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚对照品适量至250 mL 量瓶中，适量甲醇溶解，定容，制成分别含五者18.3、22.9、20.0、20.0、11.2 μg／mL 的溶液，即得。

2.2.2 供试品溶液制备

2.2.2.1 总蒽醌 取药材粉末约0.15 g，置于具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25 mL，称定质量，加热回流1 h，放冷，甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，精密量取续滤液5 mL至烧瓶中，挥去溶剂，加8%盐酸10 mL，超声处理2 min，再加三氯甲烷10 mL，加热回流1 h，放冷，置于分液漏斗中，少量三氯甲烷洗涤容器，并入分液漏斗中，分取三氯甲烷层，酸液再用三氯甲烷提取3次，每次10 mL，合并三氯甲烷液，减压回收溶剂至干，残渣加甲醇溶解，转移至10 mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.2.2.2 游离蒽醌 取药材粉末约0.5 g，精密称定，置于具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25 mL，称定质量，加热回流1 h，放冷，甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.2.3 色谱条件 Waters Bridge 十八烷基硅烷键合硅胶填料色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相甲醇⁃0.1%磷酸（85∶15）；体积流量1.0 mL／min；柱温30 ℃；检测波长254 nm；进样量10 μL。

2.3 抗菌活性研究

2.3.1 水提物制备 取药材50 g 至三角瓶中，加500 mL水，精密称定质量，浸泡30 min 后煎煮，煮沸后用文火再煮40 min，放冷，称定质量，加 水补足减失的质量，3 000 r／min离心5 min，收集上清液并记录其体积，旋转浓缩至1 g／mL，即得。

2.3.2 试验菌液制备 取金黄色葡萄球菌标准菌株适量，接种至胰酪大豆胨液体培养基中，在33 ℃下培养20 h，0.9%无菌氯化钠溶液稀释至1×104cfu／mL，即得。

2.3.3 测定方法 参照2020 年版《中国药典》中的“抗生素微生物检定法”制备双碟，采用管碟法测定。取未辐照水提物，无菌水梯度稀释成不同质量浓度，各质量浓度之间的剂距为0.8。测定1 批药材时，取双碟6只，各碟内间隔的3 只牛津杯中滴满未辐照的水提物，另3 只牛津杯中滴满同一剂量辐照后的水提物，在36 ℃下培养16 h，取出，游标卡尺测定抑菌圈直径，取平均值，以质量浓度为横坐标（X），抑菌圈直径为纵坐标（Y）进行回归，拟合量效关系方程。

2.4 统计学分析 通过SPSS 22.0 软件进行处理，组间比较采用配对样本t检验。P＜0.05 表示差异具有统计学意义。

3 结果

3.1 HPLC 指纹图谱 将总蒽醌、游离蒽醌含量的色谱图导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012 年版）》，工作状态选“分析检验”，以未辐照（0 kGy）药材色谱图为参照，设定多点校正、时间宽为0.1 进行全谱峰匹配，结果见图1～2，相似度见表1。由此可知，4 个辐照剂量处理后与未辐照时2 种蒽醌HPLC 指纹图谱的相似度均大于0.995，两者峰高和峰形也无明显差异。

图1 辐照前后总蒽醌HPLC 指纹图谱

图2 辐照前后游离蒽醌HPLC 指纹图谱

表1 相似度测定结果

3.2 总蒽醌、游离蒽醌含量 由表2 可知，辐照前后总蒽醌、游离蒽醌含量比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。

表2 辐照前后总蒽醌、游离蒽醌含量及抑菌圈直径测定结果

3.3 相关成分峰面积 在总蒽醌HPLC 指纹图谱中，唐古特大黄可标定出9 个共有峰，分别是T1～T9，而掌叶大黄可标定出9 个共有峰，分别是Z1～Z9；游离蒽醌HPLC 指纹图谱中，唐古特大黄可标定出6 个共有峰，分别是Ta～Tf，而掌叶大黄可标定出5 个共有峰，分别是Za⁃Ze。将总蒽醌HPLC 指纹图谱中相关成分峰面积进行对数转换后采用配对样本t检验，结果见表3。由此可知，当辐照剂量达到30 kGy时，唐古特大黄T6 峰与0、5、10、20 kGy 剂量时比较具有显著差异（P＜0.01），而0、5、10、20 kGy 剂量之间无显著差异（P＞0.05）；掌叶大黄Z2 峰与0、5、10、20 kGy 剂量时比较具有显著差异（P＜0.01），而0、5、10、20 kGy 剂量之间无显著差异（P＞0.05）。同法处理游离蒽醌HPLC 指纹图谱，相关成分峰面积见表4，可知各辐照剂量处理后其峰面积无显著差异（P＞0.05）。

表3 总蒽醌HPLC 指纹图谱中相关成分峰面积测定结果

表4 游离蒽醌HPLC 指纹图谱中相关成分峰面积测定结果

3.4 抗菌活性 辐照前唐古特大黄、掌叶大黄水提物的抑菌圈直径见图3，量效关系方程分别为Y＝0.447X＋16.45（R2＝0.985）、Y＝0.507X＋15.69（R2＝0.996），均在0.08～0.25 g／mL 范围内线性关系良好。在上述量效关系方程中选择质量浓度为0.16 g／mL，测定辐照前后抑菌圈直径，结果见表2，可知均无显著差异（P＞0.05）。

图3 水提物抑菌圈直径

4 讨论与结论

辐照是一种有效的灭菌方法，虽然国家规定了中药材的辐照剂量，但近年来发现实际运用中并未严格遵守。已有关于药物经较高剂量辐照后产生降解产物的报道［10⁃11］。由于药材辐照剂量随意扩大具有普遍性，故本实验考察了在当前常用剂量下对大黄有效成分、相关成分以及抗菌活性的影响。以期为辐照应用研究提供相关数据和依据。

大黄辐照前后总蒽醌和游离蒽醌HPLC 指纹图谱相关数据经统计分析表明，主要成分芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚和大黄素甲醚含量未发生变化（P＞0.05）。但当辐照剂量达到30 kGy时，总蒽醌含量指纹图谱上唐古特大黄和掌叶大黄分别有一处有关成分峰响应极显著增大（P＜0.01），说明辐照剂量增加会引起相关成分发生变化，值得进一步研究。

金黄色葡萄球菌是引起人类组织器官感染的重要致病菌［12⁃14］，据文献报道，芦荟大黄素、大黄酸、大黄素和大黄素甲醚均对其有抑制作用［15⁃16］。本研究在前期药敏试验时发现金黄色葡萄球菌对大黄水提物最敏感，这与前人报道一致［17⁃18］，故选为抗菌活性试验菌株。根据2020 年版《中国药典》“中药生物活性测定指导原则”，本研究采用剂量梯度试验，找到了药物浓度与抑菌活性量效关系的线性关系范围，从而确定了可作为比较辐照前后活性变化的浓度点。测定结果表明，在所选辐照剂量下，大黄抗金黄色葡萄球菌活性未发生变化。

由于辐照灭菌应用于中药的历史短，基础研究尚需不断完善，本研究仅考察了辐照前后大黄主要化学成分含量、相关成分和抗菌活性的变化，今后还应进一步对辐照敏感的成分进行鉴定分析，在稳定性等方面展开研究以保证用药安全。