基于网络药理学和体外实验探讨白藜芦醇治疗心力衰竭的分子机制

高彦琳 陈厚良赵胜 孙志勇 李天宇王婵成威∗

（1.安徽省第二人民医院心内科， 安徽 合肥230000； 2.合肥市第三人民医院心内科， 安徽 合肥230000）

心力衰竭为临床常见的心血管疾病，心室重构和舒张功能障碍为心力衰竭的标志，心力衰竭可导致心肌细胞肥大、凋亡以及增加心肌细胞炎症的表达和内皮功能障碍等［1⁃2］。尽管治疗心力衰竭口服药物已取得显著进展，但其副作用仍无法忽视，因此，寻找天然药物治疗心力衰竭，减少副作用，以及对疾病更深一步的机制探讨，具有重要意义［3］。

白藜芦醇是一种来源于虎杖的多酚成分，具有广泛的生理功能，包括保护心脏、抗血小板聚集和抗炎等特性［4⁃5］。已有多项研究证实，白藜芦醇在心肌缺血再灌注损伤、心肌梗塞、心肌肥厚、心律失常和心力衰竭的动物模型中具有保护作用［6⁃9］。最新研究发现，白藜芦醇可减少心力衰竭的心室重构和心功能功能恶化［1］，但是其对心力衰竭心脏保护作用的具体机制尚未完全阐明。网络药理学通过各种数据库搜集数据进行分析，并利用计算机模拟构建一个多级网络，进一步分析药物、疾病和靶点之间的联系［10⁃11］。因此，本实验利用网络药理学和实验验证研究白藜芦醇治疗心力衰竭的作用靶点，分析其相关靶点生物学途径，有利于更深一步研究其作用机制。

1 材料与方法

1.1 白藜芦醇和心力衰竭靶点的获取 利用中药系统药理学分析平台［12］（TCMSP）（http：／／tcmspw.com／）、phrammapper［13］（http：／／www.lilab⁃ecust.cn／pharmmapper／）和SwissTarget［14］数据库，以“resveratrol”为关键词检索白藜芦醇中的作用靶点，靶点通过UniProt校对。通 过CTD［15］（http：／／ctdbase.org ）、GeneCards［16］（https：／／www.genecards.org／）和DisGeNET［17］数据库，以“heart failure”为关键词检索相关基因。

1.2 白藜芦醇和心力衰竭交集靶点蛋白质互作（PPI）网络的构建 将白藜芦醇和心力衰竭筛选靶点上传韦恩图网站（http：／／bioinformatics.psb.ugent.be／webtools／Venn／），获取交集靶点，进 一步通过STRING 数据库［18］（https：／／string⁃db.org）构建蛋白质之间的相互作用网络（PPI），导入Cytoscape 3.7.2 软件，分析获取关键靶点。

1.3 交集靶点的富集分析 通过R 语言对交集基因进行GO 和KEGG 分析，进一步了解白藜芦醇治疗心力衰竭的生物过程、分子功能、细胞组成以及关键通路。

1.4 白藜芦醇与关键靶点的分子对接 从PDB 数据库获取相关蛋白分子结构，PubChem 得到白藜芦醇的详细分子结构，将蛋白和白藜芦醇结构导入PyMol 2.4.0 和Auto Dock 软件［19⁃20］，进行分子对接，利用Pymol 获取相关详情信息。

1.5 试剂与药物 白藜芦醇（纯度≥99%，美国Sigma 公司）。p⁃AKT、Akt、Bad、Bcl⁃2、caspase⁃3 抗体（美国Cell Signaling Technology 公司）；羊抗兔二抗、羊抗鼠二抗、β⁃actin 抗体（武汉爱博泰克生物科技有限公司）；TRIzol、cDNA 试剂盒、RT⁃qPCR 试剂盒（美国Thermo Fisher 公司）；CCK8 试剂盒（合肥白鲨生物科技有限公司）；戊巴比妥钠（美国Sigma 公司）。

1.6 分组、给药与造模 将大鼠心肌细胞H9c2（货号CL⁃0089，武汉普诺赛生命科技有限公司）均匀接种于96 孔板，每孔约1×104个细胞，分别给予0、12.5、25、50、75、100、150、200 μmol／L 白藜芦醇干预4 h，CCK⁃8 实验筛选得到药物最佳浓度。细胞分为正常组、白藜芦醇组、心力衰竭组和心力衰竭＋白藜芦醇组，将细胞培养48 h后，使用无血清DMEM 换液，进行同步化处理12 h，各药物干预组更换为提前配置好的白藜芦醇（无血清配置），干预4 h后进行心力衰竭细胞造模［21⁃23］，PBS 冲洗残留的白藜芦醇，心力衰竭组和心力衰竭＋白藜芦醇组加入等体积无血清含0.1%戊巴比妥钠培养基，置于培养箱1 h，若H9c2 细胞变细，部分呈圆形，少量漂浮，则表明模型建立成功。

1.7 CCK⁃8 检测细胞活性 H9c2 细胞按“1.6”项下方法分组、给药与造模，严格按照CCK⁃8 说明书操作，检测各孔在450 nm 波长处的吸光度值，计算细胞存活率。

1.8 Western blot 法检测Akt1、Bad、Bcl⁃2、caspase⁃3 蛋白表达 将H9c2 细胞于25 cm2培养瓶传代培养（传代细胞数约2.5×105个），按“1.6”项下方法分组培养后，收集各组细胞，提取总蛋白，95 ℃变性后10%SDS⁃PAGE 凝胶电泳，湿转至PVDF膜，封闭液室温封闭2 h，其中磷酸化蛋白使用5%BSA 封闭，一抗（1∶1 000）4 ℃摇床孵育过夜，二抗室温下孵育2 h，TBST 洗膜3 次后化学发光法显影，分析各条带灰度值。

1.9 RT⁃qRCR 法检测Akt、Bad、Bcl⁃2、caspase⁃3 mRNA 表达 取“1.8”项下收集的各组细胞，严格按照试剂盒说明书操作，使用TRIzol 试剂提取总RNA，逆转录合成cDNA，依次加样进行RT⁃qPCR 反应。采用2－ΔΔCT法计算目的基因mRNA 相对表达，引物序列见表1。

表1 引物序列

1.10 统计学分析 通过GraphPad Prism 8.0 软件进行处理，数据以（）表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用t检验。P＜0.05 表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 白藜芦醇靶点、心力衰竭靶点和交集靶点的获取 将获得白藜芦醇和心力衰竭靶点剔除得分较低靶点以及去重，分别获得422、821 个相关靶点，取交集得到白藜芦醇治疗心力衰竭相关靶点有144个，包括Akt1、CASP3、MAPK8和TP53 等。交集靶点韦恩图见图1。

图1 白藜芦醇与心力衰竭韦恩图

2.2 PPI 网络及白藜芦醇治疗心力衰竭的关键靶点 PPI网络如图2 所示，共有144 个节点，3 280 条边，依据Degree 值得到排名靠前的治疗心力衰竭关键靶点有TNF、MAPK3、CASP3、Akt1、JUN、VEGFA、IL6、TP53、MAPK8 和EGFR，详见表2。

表2 白藜芦醇治疗心力衰竭的关键靶点信息

图2 核心网络图

2.3 GO 和KEGG 富集分析 GO 富集分析显示生物过程（BP）主要集中在调节炎症反应、对脂多糖的反应以及各种磷脂酰肌醇3⁃激酶信号通路的调控等；细胞组成（CC）和分子功能（MF）主要集中在膜筏和转录因子活性等（图3）。KEGG 分析显示，PI3K⁃Akt 信号通路、MAPK 信号通路与脂质动脉粥样硬化通路为白藜芦醇治疗心力衰竭的重要通路（图4）。GO 生物过程与KEGG 通路得到相似的结果，即各种磷脂酰肌醇3⁃激酶信号通路的调控起到重要作用，因此，PI3K⁃Akt 通路可能为白藜芦醇治疗心力衰竭的重要通路（图5，绿色区域为信号下调靶点）。

图3 GO 功能分析

图4 KEGG 通路富集分析

图5 白藜芦醇治疗心力衰竭的信号通路靶点

2.4 分子对接分析 将白藜芦醇与Akt1、TP53、VEGFA、CASP3 和IL6 进行分子对接，亲和力＜⁃5 kcal／mol 表明结合较好，如表3 所示，白藜芦醇与上述靶点有较强的结合力，对接模式见图6。

表3 分子对接结果

2.5 不同浓度白藜芦醇对H9c2 细胞存活率的影响 与正常组比较，100、125、150、200 μmol／L 白藜芦醇可降低细胞活性（P＜0.05，P＜0.01），因此，选择75 μmol／L为白藜芦醇干预浓度，见图7。

图7 不同浓度白藜芦醇对H9c2 细胞的影响（，n＝3）

2.6 白藜芦醇对心力衰竭细胞存活率的影响 与正常组比较，心力衰竭组细胞存活率降低（P＜0.01）；与心力衰竭组比较，心力衰竭＋白藜芦醇组细胞存活率升高（P＜0.01），见图8。

图8 各组心肌细胞存活率比较（，n＝6）

2.7 白藜芦醇对心力衰竭细胞Akt、Bad、Bcl⁃2、caspase3蛋白表达的影响 如图9 所示，与正常组比较，心力衰竭组细胞Akt、Bad、caspase⁃3 蛋白表达升高（P＜0.01），Bcl⁃2 蛋白表达降低（P＜0.01）；与心力衰竭组比较，心力衰竭＋白藜芦醇组细胞Akt、Bad、caspase⁃3 蛋白表达降低（P＜0.01），Bcl⁃2 蛋白表达升高（P＜0.01）。

图9 各组细胞p⁃Akt、Akt、Bad、Bcl⁃2、caspase⁃3 蛋白表达比较（，n＝3）

2.8 白藜芦醇对心力衰竭细胞Akt、Bad、Bcl⁃2、caspase⁃3 mRNA 表达的影响 如图10 所示，与正常组比较，心力衰竭组细胞Akt、Bad、caspase⁃3 mRNA 表达升高（P＜0.05，P＜0.01），Bcl⁃2 mRNA 表达降低（P＜0.01）；与心力衰竭组比较，心力衰竭＋白藜芦醇组细胞Akt、Bad、caspase⁃3 mRNA 表达降低（P＜0.01），Bcl⁃2 mRNA 表达升高（P＜0.01）。

图10 各组细胞Akt、 Bad、 Bcl⁃2、 caspase⁃3 mRNA 表达比较（，n＝3）

3 讨论

本研究共获得144 个白藜芦醇治疗心力衰竭的靶点，根据PPI 网络发现Akt1、TP53、VEGFA、CASP3 和IL⁃6 为治疗的核心靶点。最新临床实验研究证明，摄入白藜芦醇可通过降低心力衰竭心肌炎症因子表达进一步改善心室重构和心功能指标［24］，本研究在心力衰竭细胞模型上发现白藜芦醇调节PI3K／Akt1／Bad／Bcl⁃2 通路抗心力衰竭凋亡。

GO 分析结果提示，白藜芦醇治疗心力衰竭生物过程主要集中在各种磷脂酰肌醇3⁃激酶信号通路的调控等，而KEGG 富集分析同样发现PI3K⁃Akt 信号通路为白藜芦醇治疗心力衰竭的重要通路。多项研究证明，白藜芦醇在心力衰竭中具有抗凋亡、降低炎症因子表达和抗增殖等保护作用［1，9，24］。PI3K⁃Akt 号通路具有调控细胞凋亡和增殖等功能［25］，在心力衰竭中，降低PI3K／Akt 的表达能进一步提高心肌细胞抗凋亡能力，从而缓解心室重构［26］。因此，通过进一步筛查PI3K⁃Akt 关键通路中的下调靶点，发现Akt1／Bad／Bcl⁃2 在白藜芦醇治疗心力衰竭中可能起到关键抗凋亡作用。

多项研究表明，减少心力衰竭中Akt1 表达能明显减缓心肌细胞的自噬和凋亡［27⁃28］。Yan 等［29］发现，miR⁃31a⁃5p在心力衰竭中通过靶向Tp53 介导了肾素⁃血管紧张素⁃醛固酮系统触发的心肌细胞凋亡。VEGFA 具有促进增殖、迁移并抑制细胞凋亡的功能，敲除VEGFA 的小鼠更易出现心力衰竭［30］；而在心力衰竭大鼠模型中发现，上调心脏中毛细血管VEGFA 表达，能进一步促进新生血管生成达到抗心力衰竭作用［31］。caspase⁃3 主要在凋亡早期和晚期中发挥作用，在心力衰竭中凋亡蛋白表达明显增多，减少caspase⁃3表达能明显改善心功能［32］。IL⁃6 为促炎细胞因子，与心力衰竭心功能进一步恶化密切相关［33］，马伟利等［34］临床研究表明，药物联合治疗后可明显降低心力衰竭患者IL⁃6 表达，进一步改善患者心功能。本研究发现，75 μmol／L 白藜芦醇能增加心力衰竭细胞活性，降低核心靶点Akt1、caspase⁃3 以及关键通路凋亡因子Bad 蛋白和mRNA 表达，同时升高抗凋亡蛋白Bcl⁃2 蛋白和mRNA 表达。分子对接提示，白藜芦醇与核心靶点具有较好的结合作用。以上结果表明，白藜芦醇可能通过调控Akt1／Bad／Bcl⁃2 通路减少心力衰竭凋亡蛋白caspase⁃3 的表达。

综上所述，本研究通过网络药理学方法确定了白藜芦醇治疗心力衰竭的关键成分、核心靶点和途径。通过心力衰竭心肌细胞模型验证了白藜芦醇对心力衰竭保护作用的可能机制，表明白藜芦醇可能通过Akt1／Bad／Bcl⁃2 通路，进一步减少心力衰竭凋亡蛋白的表达，从而起到治疗作用。