基于网络药理学探讨祛瘀散结胶囊治疗子宫肌瘤的作用机制

龙立活 陆永梅何佳 高红伟 奉建芳 唐红珍

（1.广西药用植物园， 广西 南宁530012； 2.广西中医药大学， 广西 南宁530200）

子宫肌瘤是良性子宫肿瘤最常见的形式，临床主要治疗策略以手术干预和激素调控为主，存在患者依从性差、药物副作用多以及疾病复发率高等问题，严重影响女性的身心健康，也对全球卫生保健服务和成本具有深远的影响［1⁃4］。因此，亟需寻找和发掘兼得有效缓解疾病症状和不影响生育功能的治疗药物。

祛瘀散结胶囊是由白花蛇舌草、白英、山慈菇、夏枯草、三七等15 味中药制成的胶囊剂，多用于治疗瘀血阻络引起的乳房胀痛、乳腺增生病、乳癖等疾病，因其具有祛瘀消肿、散结止痛等功效，临床上也被应用于子宫肌瘤治疗，已取得良好治疗效果，具有广泛应用前景，但因其成分复杂，目前仍未见其干预子宫肌瘤的有效成分及机制报道［5⁃6］。

中药复方是一个复杂的多成分⁃多靶点交互体系，它的药效不是简单的药味加和，而是各药味间相互影响，网络药理学在揭示中药复方的复杂成分及治病机理时，不仅需要对复方中各药物成分进行独立分析，还要对药物间的关系进行综合性讨论［7］。本研究拟通过网络药理学和分子对接技术探讨方剂⁃药物⁃成分⁃靶点⁃通路⁃疾病间的联系，采用相关动物实验加以验证，旨在为研究祛瘀散结胶囊治疗子宫肌瘤的作用机制提供基础。

1 材料与方法

1.1 祛瘀散结胶囊活性成分及靶点收集 采用ETCM（http：／／www.tcmip.cn／ETCM／index.php／Home／）、TCMSP（https：／／tcmsp⁃e.com／user／login／index.html）等数据库及相关文献，以“白花蛇舌草”“白英（白毛藤）”“山慈菇”“夏枯草”“三七”“土鳖虫”“蜈蚣”“山楂”“枳壳”“仙鹤草”“苦楝皮”“冰片”“黄芪”“麦芽”“甘草”为关键词，对祛瘀散结胶囊中各药味的成分信息及相关靶点进行收集，将所得成分在TCMSP 中按照口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%、类药性（drug⁃likeness，DL）≥0.18 的药物动力学（absorption，distribution，metabolism and excretion，ADME）参数条件进行初筛，获取主要活性成分，采用Uniport（https：／／www.uniprot.org／）及 NCBI Gene（https：／／www.ncbi.nlm.nih.gov／gene）对所得蛋白和其基因信息标准化为相应基因简称。

1.2 疾病靶点预测及交互靶点 以“Uterine fibroide”“Uterine fibroids”“fibroid”作为检索词纳入人类基因数据库（GeneCards）（https：／／www.genecards.org／）进行高级检索，获得子宫肌瘤相关靶点，再采用网络药理学蛋白交集Venny 2.1.0（https：／／bioinfogp.cnb.csic.es／tools／venny）在线工具获得“祛瘀散结胶囊”与“子宫肌瘤”交集的“中药⁃疾病”交互蛋白靶点，并绘制韦恩图。

1.3 交互靶点蛋白互作（PPI）网络构建 将“1.2”项下得到的交互靶标导入STRING（https：／／string⁃db.org／）数据库，选择Multiple Protenin，限定物种Homo sapiens，最低要求互动分数为“medium confidence”（＞0.4），其余设置均遵循系统默认，构建蛋白互作（protein protein interaction，PPI）网络图。

1.4 交互靶点GO 和KEGG 富集分析 将交集靶标导入STRING 数据库中，设置条件为阈值P＜0.05，物种来源为Homo sapiens，进行基因功能富集分析和KEGG 通路富集分析，从细胞组成（cellular component，CC）、分子功能（molecular function，MF）、生物过程（biological process，BP）及KEGG 信号通路等方面提供基因功能的详细注释。

1.5 交互靶点分子对接 从PubChem 数据库（https：／／pubchem.ncbi.nlm.nih.gov／）获取主要活性成分sdf 格式的2D 结构，用ChemBio3D 能量最小化转化为三维结构，保存为mol2 格式；从RCSB PDB 数据库（https：／／www.rcsb.org）获取PDB 号下载下载靶标蛋白的3D 结构，并使用PyMol 软件删除水分子和原配体。以蛋白作为受体，以小分子作为配体，根据靶蛋白复合物中配体的坐标确定分子对接的活性位点，采用AutoDock Vina 进行分子对接，用PyMol 进行相关作图。

1.6 试剂与药物 祛瘀散结胶囊（批号Z20026689），购自广西圣康制药有限公司。苯甲酸雌二醇注射液［2 mg／mL，批号（2016）110252511］、黄体酮注射液（10 mg／mL，批号110251670），均购自宁波第二激素厂；米非司酮（阳性药，批号M830038），购自上海麦克林生化科技有限公司；大鼠雌二醇（E2）ELISA 试剂盒（批号MM⁃0575R1）、大鼠雌激素受体（ER）ELISA 试剂盒（批号MM⁃0567R1）、大鼠孕激素受体（P）ELISA 试剂盒（批号MM⁃0551R1），均购自江苏酶免实业有限公司。

1.7 仪器 OHAUS 1／1000 型电子天平，购自奥豪斯仪器（上海）有限公司；BCD⁃143KA1 型电冰箱，购自TCL 科技集团股份有限公司；PM⁃10AD 型显微镜、BX⁃60 型病理图像分析仪，均购自日本Olympus 公司；MP60 型显微照相系统、RM2125 型切片机，均购自德国Leica 公司；5425R 型低温高速离心机，购自德国Eppendorf 公司；Synergy H1 型酶联免疫检测仪，购自美国BioTek 公司；TP⁃24 型组织研磨机，购自杰灵仪器制造（天津）有限公司。

1.8 动物 雌性SD 大鼠，未孕，体质量200～220 g，购自浙江维通利华实验动物技术有限公司，实验动物生产许可证号SCXK（浙）2019⁃0001，饲养条件为室温（25±2）℃，相对湿度40%～70%，自然明暗周期，自由饮食。本实验获得广西中医药大学动物实验伦理委员会批准（编号DW20210621⁃035）。

1.9 造模、分组及给药 SD 大鼠适应性饲养3 d后，采用雌激素负荷法造模，除正常组外，各组大鼠每天均给予肌肉注射苯甲酸雌二醇（0.5 mg／kg），隔天每只大鼠增加注射黄体酮（1 mg／kg），连续注射9周，每天称定体质量1次，并根据体质量调整造模药物用量，经大鼠子宫病理学显示腺体增生及肌纤维明显增生，提示造模成功。造模成功的大鼠按体质量随机分为5组，每组8只，米非司酮组每天腹腔注射米非司酮1.25 mg／kg，祛瘀散结胶囊各剂量组灌胃给予0.3、0.6、0.9 g／kg 祛瘀散结胶囊，正常组及模型组每天灌胃给予等量生理盐水。在正常情况下，大鼠子宫质量与体质量的比值，即子宫系数恒定；当子宫受损发生充血、水肿或增生肥大等状态后，子宫系数增大，数值越大表示受损程度越重。

1.10 检测指标

1.10.1 子宫病理学检查 给药期间观察各组大鼠行为学状态，给药4 周后打开大鼠腹腔，观察子宫和肌瘤形态，沿子宫膀胱连接处剪取子宫，剥离脂肪，拍照，称定质量，计算子宫系数；将新鲜病变组织于多聚甲醛溶液中固定，行HE 染色。

1.10.2 雌二醇（E2）、孕酮（P）、雌激素受体（ER）水平检测 大鼠腹腔麻醉后腹主动脉取血，收集全血于无抗凝采集管中，室温放置30 min，4 ℃、3 000 r／min 离心20 min，分离得血清，分装后保存于－80 ℃待测；精密称取剩余子宫组织100 mg，加冰生理盐水0.9 mL，使用组织研磨机研磨，4 ℃、10 000 r／min 离心10 min，取上清液待测，按相应试剂盒说明书检测血清及子宫组织中雌二醇（E2）、孕酮（P）、雌激素受体（ER）水平。

1.11 统计学分析 通过GraphPad Prism 7 软件进行处理，计量资料以（）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用t检验。P＜0.05 表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 网络药理学分析

2.1.1 祛瘀散结胶囊活性成分筛选 通过ETCM、TCMSP数据库检索共获得祛瘀散结胶囊1 015 种成分，按照TCMSP 中设定的ADME 参数条件筛选并去除无靶点化合物，删除重复靶点后得到活性成分为132个，共计268 个靶标，具体见表1。其中，潜在靶标个数较多的活性成分有槲皮素、山柰酚、木犀草素、芒柄花黄素、β⁃谷甾醇等，其靶标个数分别为148、62、56、45、38。

表1 祛瘀散结胶囊包含的化合物和对应潜在靶标个数（个）

2.1.2 子宫肌瘤靶点预测及“祛瘀散结胶囊⁃子宫肌瘤”交互靶点筛选 通过GeneCards 数据库数据，以“fibroid”“Hysteromyoma”“Uterine fibroid”作为检索词收集得到子宫肌瘤治疗相关靶点共计996 个。通过网络药理学蛋白交集Venny 2.1.0（https：／／bioinfogp.cnb.csic.es／tools／venny）在线工具获取“祛瘀散结胶囊”与“子宫肌瘤”交集的“中药⁃疾病”交互靶点共52个，为ESR1、PTGS2、NCOA2、PGR、BCL2、BAX、CASP3、MAP2、PPARG、MMP3、NOS3、RELA、EGFR、CCND1、CDKN1A、PLAU、MMP2、MMP9、IL10、TNF、CDKN2A、TP53、XDH、MMP1、HIF1A、ERBB2、GJA1、CYP1A1、VCAM1、PRKCB、BIRC5、CYP1B1、PLAT、THBD、PTEN、MPO、NFE2L2、COL3A1、CHEK2、INSR、SPP1、ERBB3、GSTM1、ESR2、CDK2、FASN、CYP19A1、PPARA、ADIPOQ、PCNA、EDN1、PLA2G4A，韦恩图见图1。

图1 祛瘀散结胶囊与子宫肌瘤交互靶点韦恩图

2.1.3 “祛瘀散结胶囊⁃子宫肌瘤”交互靶点PPI 网络构建 利用STRING 数据库对交互靶点进行蛋白互作网络分析，绘制PPI 网络图（图2），图中网络节点为52个，相互作用连线有527条，平均度值为20.3。节点表示由此蛋白质编码基因位点单独产生的所有蛋白，颜色表示聚类，大小反应度值；节点间的连线则表示连线两端的蛋白存在直接或间接的相互作用；颜色反应作用类型和相互关系判定来源。

图2 交互靶点PPI 网络图

2.1.4 “祛瘀散结胶囊⁃子宫肌瘤”交互靶点富集分析 从STRING 生物信息在线数据库中确定GO 条目1 118条，生物学过程1 008条，主要涉及对含氧化合物、有机物质、化学品、脂质的反应，细胞对化学刺激、有机物质、含氧化合物的反应，调节细胞群增殖，对细胞过程的积极调节，生物过程的积极调节等；细胞组成33条，涉及子宫内膜系统、宿主细胞核、细胞质、蛋白复合物、细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶全酶复合物、蛋白激酶复合物、细胞外空间、膜结合细胞器、胞内细胞器及细胞外区域等；分子功能77条，与信号受体、蛋白质、酶、同蛋白、过渡金属离子、DNA 结合转录因子、RNA 聚合酶Ⅱ特异性DNA结合转录因子、转录因子等结合及蛋白质结构域特异性结合等密切相关，以上分析均根据显著性选取排名前十的条目作图，具体见图3。KEGG 富集信号通路137条，主要涉及癌症通路、癌症microRNA 通路、糖尿病并发症AGE⁃RAGE 信号通路、液体剪切应力和动脉粥样硬化信号通路、内分泌抵抗信号通路、癌症中的蛋白聚糖、HIF⁃1 信号通路等，根据其显著性选取排名前20 的通路作图，具体见图4。

图3 交互靶点GO 功能富集分析

图4 KEGG 通路富集分析结果

2.1.5 分子对接 为了进一步验证祛瘀散结胶囊有效化学成分的潜在靶标，将主要活性成分与潜在靶标进行分子对接。将交互靶点PPI 网络图的TSV 文件导入Cytoscape 3.6.0 中分析节点信息，筛选出前6 个核心调控基因靶点，结果见表2。以主要活性成分中潜在靶标数最多的槲皮素（quercetin）作为代表性成分，与TP53、TNF、CASP3、ESR1、MMP9 和INS 进行分子对接分析验证，结果见图5。

图5 槲皮素与关键靶点分子对接的模式图

表2 祛瘀散结胶囊治疗子宫肌瘤关键靶点拓扑学分析

2.2 验证实验结果

2.2.1 祛瘀散结胶囊对大鼠行为学的影响 造模前各组大鼠性情温和，毛色润泽柔顺，进食饮水良好；造模3 周后，大鼠出现毛色发黄、皮毛凌乱状态，部分大鼠还有脱毛症状，且随造模时间推移，脱毛大鼠数量增多，脱毛面积增大，且大鼠处于易激怒状态，喜斗殴，善攻击；祛瘀散结胶囊及米非司酮给药后，大鼠情况有所改善，毛色有恢复迹象，情绪渐渐恢复稳定。

2.2.2 祛瘀散结胶囊对大鼠子宫形态的影响 如图6A 所示，正常组子宫组织质地均匀，颜色鲜亮，两侧子宫对称，呈Y形，未见结节或囊肿；模型组大鼠子宫根部明显增粗，颜色黯淡，并可触摸到有不同程度米粒大小肿块；祛瘀散结胶囊各剂量组和米非司酮组大鼠子宫质地均匀，颜色较淡，未见明显的囊肿、结节及肿胀，增生程度明显减轻。如图6B所示，与正常组比较，模型组大鼠子宫系数增加（P＜0.01）；与模型组比较，米非司酮组和祛瘀散结胶囊各剂量组大鼠子宫系数降低（P＜0.01），并呈剂量依赖性。结果提示，祛瘀散结胶囊对大鼠子宫肌瘤具有显著的治疗作用。

图6 祛瘀散结胶囊对大鼠子宫形态的影响（，n＝8）

2.2.3 祛瘀散结胶囊对大鼠子宫组织病理变化的影响 正常组大鼠子宫平滑细胞排列整齐、紧密，形态正常，色泽均一，肌层未见炎性细胞浸润，未出现增生；模型组大鼠子宫平滑肌增厚，细胞边界不清晰，细胞核出现扁圆形状，肌纤维排列紊乱无序，可见明显炎性细胞浸润；米非司酮组和祛瘀散结胶囊各剂量组大鼠子宫平滑细胞排列较为整齐，色泽均一，形态正常，肌层炎性细胞浸润减少，病理状态明显改善，见图7。

图7 各组大鼠子宫组织HE 染色（×100）

2.2.4 祛瘀散结胶囊对大鼠血清E2、P、ER 水平的影响 如图8 所示，与正常组比较，模型组大鼠血清E2、P、ER 水平均升高（P＜0.01）；与模型组比较，祛瘀散结胶囊低剂量组血清ER 水平降低（P＜0.05），E2、P 水平无明显变化（P＞0.05），米非司酮组和祛瘀散结胶囊中、高剂量组血清E2、P、ER 水平均降低（P＜0.05）。

图8 祛瘀散结胶囊对大鼠血清E2、P、ER 水平的影响（，n＝8）

2.2.5 祛瘀散结胶囊对大鼠子宫组织E2、P、ER 水平的影响 如图9 所示，与正常组比较，模型组大鼠子宫组织E2、P、ER 水平均升高（P＜0.01）；与模型组比较，米非司酮组和祛瘀散结胶囊各剂量组大鼠子宫组织E2、P、ER 水平均降低（P＜0.01）。

图9 祛瘀散结胶囊对大鼠子宫组织E2、P、ER 水平的影响（，n＝8）

3 讨论

本研究根据网络药理学方法预测得到，祛瘀散结胶囊治疗子宫肌瘤有6 个核心调控基因，包括TP53、TNF、CASP3、ESR1、MMP9 和PTGS2。TP53 是最重要的抑瘤基因之一，已有研究发现子宫肌瘤患者p53 呈高表达［8⁃9］；TNF⁃α 参与炎症反应及免疫应答，子宫肌瘤清除手术术前TNF⁃α 水平偏高的患者术后复发率更高［10］；子宫肌层的CASP3 是子宫静止期的潜在调节因子；ESR1 编码雌激素受体，对子宫肌瘤的生长有着重要影响［11⁃12］；MMP9 是人体最重要的蛋白酶之一，可降解肿瘤周边基质和血管基底膜，促进肿瘤突破包裹增殖［13］；PTGS2 是前列腺素类生物合成途径中的限速酶，在炎症反应中起特殊作用［14］。KEGG 信号通路富集分析得到，祛瘀散结胶囊治疗子宫肌瘤主要涉及癌症通路、糖尿病并发症中AGE⁃RGE 通路、液体剪切应力与动脉粥样硬化通路、内分泌抵抗、HIF⁃1 通路等信号通路，祛瘀散结胶囊中活性成分对应的核心调控基因富集于癌症通路。有研究表明，子宫肌瘤是一种性激素依赖性疾病，高雌激素长期刺激引起子宫肌层异常增殖，产生子宫肌瘤病灶；孕激素激活病灶处肌瘤细胞表面雌激素受体，促进肌瘤细胞生长繁殖，二者共同促进肌瘤生长。因此，激素相关的内分泌抵抗信号通路，是治疗子宫肌瘤的重要途径［15⁃17］。本研究发现，祛瘀散结胶囊能抑制子宫肌瘤模型大鼠血清与子宫组织中E2、P、ER 水平，降低子宫系数，减少肌瘤数量和大小，改善子宫病理状态。癌症通路和内分泌抵抗通路可能为祛瘀散结胶囊治疗子宫肌瘤的关键通路。

槲皮素为祛瘀散结胶囊中多味药物共有的活性成分，分子对接结果 显示，槲皮素与 TP53、TNF、CASP3、MMP9、PTGS2 等关键靶标蛋白对接良好。已有研究表明，槲皮素具有良好的抗肿瘤作用，可下调PI3K⁃Akt 信号通路，抑制肿瘤细胞的增殖与侵袭［18］；在SCG7901 细胞中，上调p53 的表达可抑制其增殖与迁移［19］；下调MMP9 蛋白的表达可实现对SiHa 细胞迁移和侵袭能力的抑制［20］。槲皮素还可通过调节细胞周期蛋白依赖性激酶抑制物（Cdkn1a）、半胱天冬酶3（caspase 3）等与细胞凋亡相关基因表达，提高β 细胞在高糖条件下的存活率［21］，抑制炎性介质TNF⁃α、PTGS2 的表达和基质金属蛋白酶（MMPs）的生成［22］。槲皮素可能作为祛瘀散结胶囊中关键药效分子参与治疗子宫肌瘤。

综上所述，本研究发现祛瘀散结胶囊可能通过多靶点、多通路治疗子宫肌瘤，为其后续研究和临床使用提供了新思路和理论基础。但本研究仍存在一定的局限性，未对祛瘀散结胶囊具体作用机制作出深入探讨，因此祛瘀散结胶囊的有效活性成分及完整调控机制仍需进一步研究来探讨验证。