参苓白术散与肾气丸干预脾肾阳虚型溃疡性结肠炎大鼠的代谢组学研究

王婧婧 古诗琴蔡莹 孙相如 杨艳红 胡方林

（湖南中医药大学， 湖南 长沙410208）

溃疡性结肠炎是一种主要累及直肠、结肠黏膜和黏膜下层的慢性非特异性炎症，属于炎症性肠病范畴，临床主要表现为腹泻、腹痛、黏液脓血便及里急后重等［1］。中医基于“病证结合”与“辨证论治”的诊疗体系及治疗方式，在促进溃疡愈合、减轻患者症状、增强体质等方面取得了显著的疗效。

溃疡性结肠炎可归属于中医学中“休息痢”“大瘕泻”“大肠胀”等范畴，邪客于大肠，与气血搏结，血络损伤，肉腐成脓，如迁延不愈，进展至疾病后期，多会出现脾肾阳虚的表现［2］。明代医家薛己首创朝夕互补法治疗虚损病，朝用补中益气汤，夕用肾气丸治疗脾肾亏损证［3］。脾肾阳虚型溃疡性结肠炎久泄伤阴，阴损及阳，临床朝用参苓白术散培补脾土，健脾止泻，滋其化源；夕用肾气丸温补肾阳，补火生土，脾肾并重治疗脾肾阳虚型溃疡性结肠炎疗效显著［4］，但其作用机制尚不明确。

代谢组学因其具有高通量、高灵敏度、高精确性的优势，能定性或定量动态检测机体小分子代谢产物的变化，具有整体性和动态性［5⁃6］。因此，本研究采用基于LC⁃QTOF⁃MS 的代谢组学方法，对脾肾阳虚型溃疡性结肠炎大鼠结肠组织代谢物进行分析鉴定，筛选差异代谢物，从内源性代谢角度探讨参苓白术散与肾气丸“朝夕互补”干预脾肾阳虚型溃疡性结肠炎的作用机制。

1 材料

1.1 动物 SPF 级雄性SD 大鼠32只，体质量（200±20）g，购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司，实验动物生产许可证号SCXK（湘）2019⁃0009。大鼠分笼饲养于湖南中医药大学实验动物中心SPF 级动物房，温度22～26 ℃，相对湿度40%～65%。本研究方案经湖南中医药大学实验动物伦理委员会批准（编号LL2020090901）。

1.2 药物 参苓白术散（人参15 g、白术15 g、白茯苓15 g、炒甘草10 g、薏苡仁9 g、莲子肉9 g、缩砂仁6 g、白扁豆12 g、炒桔梗6 g、山药15 g、大枣3 枚）、肾气丸（干地黄24 g、山药12 g、山茱萸12 g、泽泻9 g、茯苓9 g、牡丹皮9 g、炮附子3 g、桂枝3 g），药材饮片均购自湖南中医药大学第一附属医院门诊中药房，经湖南中医药大学胡方林教授鉴定为正品。按原方比例称取药材［7］，常规煎法煎煮2次，第1 次加8 倍量水浸泡30 min，煎煮1 h，取煎液，第2 次加5 倍量水，煎煮30 min，取煎液，2 次煎液混合后浓缩，参苓白术散汤剂和肾气丸汤剂分别浓缩至生药量1 g／mL。大黄中药材煎煮方法同前，浓缩至生药量1.35 g／mL，4 ℃冰箱保存备用［8］。美沙拉嗪肠溶片研磨成粉剂备用。

1.3 试剂 三硝基苯磺酸（TNBS，批号SLCG2384），购自美国Sigma 公司；氢化可的松注射液（批号2008201），购自国药集团容生制药有限公司；便隐血（OB）试剂（批号B200901），购自珠海贝索生物技术有限公司；美沙拉嗪肠溶片（批号20200604），购自黑龙江天宏药业股份有限公司。乙腈、甲酸均为色谱纯，购自德国默克公司。

1.4 仪器 液相色谱⁃四级杆／飞行时间质谱联用仪（型号Triple TOFTM5600，美国AB SCIEX 公司）；脱水机、包埋机（型号JJ⁃12J、JB⁃P5，武汉俊杰电子有限公司）；病理切片机（型号RM2016，上海徕卡仪器有限公司）；正置光学显微镜、成像系统（型号Nikon Eclipse E100、Nikon DS⁃U3，日本尼康公司）。

2 方法

2.1 造模 脾肾阳虚型溃疡性结肠炎大鼠模型的建立采用病证结合法，参考文献［8］ 报道，第一阶段复制“脾虚”模型，正常组大鼠灌胃给予蒸馏水，每只2 mL，模型组大鼠上午灌胃给予大黄水煎液，每只2 mL，连续14 d；第二阶段复制“脾肾阳虚”模型，第15 天在模型组大鼠左右肢臀部交替处肌肉注射氢化可的松25 mg／kg，连续10 d，第25 天禁食不禁水，第26 天用100 mg／kg TNBS 加50%乙醇0.25 mL 混合试剂灌肠，正常组用等体积蒸馏水灌肠，进而建立脾肾阳虚型溃疡性结肠炎大鼠模型。

2.2 模型评判标准 造模后第3天，从正常组和模型组分别随机选取2 只大鼠处死，镜下观察结肠组织结构、炎症及溃疡损伤等情况。参照《中医虚证辨证参考标准》的“证候诊断”标准［9］进行评价，①大便溏泄，甚则脱肛；②消瘦，食欲下降，体质量减轻；③畏寒，弓背，蜷缩聚堆；④神态萎靡，毛色枯槁无光泽；⑤易疲劳乏力，嗜卧，第①～③项为脾肾阳虚证主症，第④⑤项为脾肾阳虚证兼症。具备2 项主症及2 项兼症即可认为脾肾阳虚证模型复制成功。在宏观体征表现的基础上，结合镜下结肠黏膜病理变化判断模型制备成功与否。

2.3 分组与给药 脾肾阳虚型溃疡性结肠炎成模大鼠按随机数字表法分为模型组、朝夕互补方组、美沙拉嗪组，每组7 只。从造模后第7 天开始给药，药物剂量按成人临床等效剂量换算为大鼠给药剂量［10］，朝夕互补方组上午灌胃给予5.04 g／kg 参苓白术散汤剂，下午灌胃给予3.645 g／kg肾气丸汤剂；美沙拉嗪组灌胃给予0.18 g／kg 美沙拉嗪混悬液；正常组和模型组灌胃给予1 mL／kg 0.9%生理盐水，每天上午9 时～10 时灌胃，下午5 时～6 时灌胃，连续21 d。

2.4 大鼠一般情况观察 观察大鼠的精神状态、毛发色泽、饮食量、大便性状、死亡等情况。

2.5 大鼠疾病活动指数（DAI）评分 从给药第1 天起，每3 d 记录大鼠体质量变化、粪便性状和隐血，采用匹拉米洞半定量检测法检测大鼠粪便隐血。参考Hamamoto［11］标准进行DAI 评分，见表1，评估造模后溃疡性结肠炎的活动程度。DAI 评分＝（体质量下降计分＋大便性状计分＋大便隐血情况计分）／3。

表1 DAI 评分标准

2.6 结肠组织病理形态评价 取出固定于4%多聚甲醛溶液中的病变结肠组织，石蜡包埋后制作病理切片，再进行HE 染色。镜下观察结肠组织结构、炎症及溃疡损伤等情况。参照Morris［12］标准评分，见表2，求和并取平均值。

表2 病理组织学评分标准

2.7 结肠组织代谢组学检测

2.7.1 色谱条件 Waters Acquity HSS T3 色谱柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；流动相0.1% 甲酸溶液（A）⁃乙腈（B），梯度洗脱（0～13 min，1%B；13～16.5 min，99%B；16.5～20 min，1%B）；体积流量0.3 mL／min；柱温40 ℃；进样量3 μL。

2.7.2 质谱条件 采用电喷雾离子化源（ESI），正负离子模式检测；正离子喷雾电压（ISVF）5 500 V，负离子ISVF－4 500 V；雾化气温（TEM）550 ℃；雾化气（GS1）和辅助气（GS2）均为55 psi；气帘气（CUR）35 psi；正离子碰撞能量（CE）10 V，负离子CE－10 V；正离子去簇电压（DP）80 V，负离子DP－80 V；扫描范围60～1 000m／z。

2.7.3 数据处理及多元统计分析 使用Proteo Wizard 软件将质谱原始数据转成mzXML 格式，使用XCMS 进行保留时间矫正、峰识别、峰提取、峰积分、峰对齐等。利用R 语言中的StatTarget 包对信号进行校正，各组积分峰面积值为代谢物的含量，以（）表示。将 数据导入Metabo Analyst4.0（www.metaboanalyst.ca）软件进行归一化处理后，应用主成分分析（principal component analysis，PCA）和偏最小二乘判别分析（partial least square discriminant analysis，PLS⁃DA）分别显示不同组别在计分图上的分布。PCA 在最大程度提取原始信息的同时对数据进行降维处理，通过主成分来描述机体代谢的情况；PLS⁃DA 则可使组间差异最大化。为了寻找潜在的生物标志物，通过组与组之间两两对比，从正交偏最小二乘判别分析（orthogonal partial least squares discriminant analysis，OPLS⁃DA）负荷图中筛选VIP ＞1.5（VIP 表示投影中可变重要性）的离子，并对这些离子进行t检验、变异倍数分析FC（fold change analysis）的单变量统计检验。P＜0.05 并且FC＞1.5（或＜0.67）的离子最终被认为是潜在的内源性差异代谢物。利用鉴定出的差异代谢物KEGG ID 进行代谢通路分析。

2.8 统计学分析 通过SPSS 26.0 软件进行处理，计量资料以（）表示，单变量的计量资料样本均数间比较，若符合正态分布，用单因素方差分析，多重比较用LSD 分析。P＜0.05 为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 朝夕互补方对脾肾阳虚型溃疡性结肠炎大鼠一般情况的影响 与正常组大鼠比较，模型组大鼠出现蜷卧少动，行动迟缓，喜扎堆，弓背，腹胀，毛发乱无光泽，耳及四肢爪甲色淡白，舌质紫暗，尿液清，大便稀溏色黑，肛周污染，生物学表征符合脾肾阳虚型溃疡性结肠炎的临床证候特点；美沙拉嗪组大鼠大便由稀溏转为松散，颜色由黑转为黄褐色，腹胀减轻，毛发逐渐光泽，行动稍迟缓，喜扎推，无弓背，耳及四肢爪甲色淡红；朝夕互补方组大鼠大便形状逐步恢复正常，由稀溏转为松散至颗粒状，颜色由黑转为黄褐色，尿液色淡黄，无腹胀，毛发逐渐光泽，行动逐步灵活，耳及四肢爪甲色逐渐红润。

3.2 朝夕互补方对脾肾阳虚型溃疡性结肠炎大鼠DAI 评分的影响 模型组大鼠DAI 评分随时间延长呈上升趋势，且高于正常组；从治疗第3 天开始，美沙拉嗪组和朝夕互补方组大鼠DAI 评分呈下降趋势，朝夕互补方组大鼠DAI 评分趋于正常组，且优于美沙拉嗪组，见图1。

图1 各组大鼠DAI 评分（n＝7）

3.3 朝夕互补方对脾肾阳虚型溃疡性结肠炎大鼠结肠组织病理变化的影响 正常组大鼠结肠组织表面光滑良好，黏膜各层结构完整，无炎性细胞浸润，黏膜无充血水肿及溃疡形成；模型组大鼠结肠黏膜充血水肿、溃疡形成，黏膜组织可见大量炎性细胞（如中性粒细胞）浸润，病理评分高于正常组（P＜0.01）；与模型组比较，各给药组大鼠结肠黏膜结构有不同程度的改善，炎性细胞浸润减少，组织病理评分均低于模型组（P＜0.01），其中朝夕互补方作用优于美沙拉嗪，见图2、表3。

表3 各组大鼠结肠组织病理评分比较（，n＝7）

表3 各组大鼠结肠组织病理评分比较（，n＝7）

注：与正常组比较，∗∗P＜0.01 ；与模型组比较，＃＃P＜0.01。

图2 各组大鼠结肠组织病理图（HE，×200）

3.4 朝夕互补方对脾肾阳虚型溃疡性结肠炎大鼠结肠组织代谢组学的影响

3.4.1 结肠组织PCA、PLS⁃DA 分析 点代表样本，所有样本点均分布在95% 置信区间。图3A 为PCA 分析结果，正常组与模型组完全分离，其代谢轮廓相异；朝夕互补方组、美沙拉嗪组在正常组与模型组之间。图3B 为PLS⁃DA分析结果，正常组、模型组、朝夕互补方组、美沙拉嗪组样本分离，说明其代谢轮廓相异。提示，朝夕互补方干预后，脾肾阳虚型溃疡性结肠炎大鼠结肠组织代谢轮廓向正常组靠近，表明内源性代谢紊乱有所改善。

图3 各组大鼠结肠组织PCA（A）、PLS⁃DA（B）得分图

3.4.2 PLS⁃DA 交叉验证 交叉验证用于评价模型的质量，R2为模型建立的准确率，R2越高，表示模型的质量高。Q2为模型的预测准确率，Q2越高，表示模型的预测能力越高。由图4 可得，大鼠结肠组织样本R2＝0.996，Q2＝0.749，说明模型的质量与预测准确率均较好，不存在“过拟合”现象。

图4 大鼠结肠组织PLS⁃DA 交叉验证图

3.4.3 差异代谢物的筛选 以VIP＞1.5、P＜0.05、FC＞1.5（或＜0.67）为筛选条件，最终得到26 个模型组与正常组间差异代谢物，对这些差异代物的定量信息进行热图分析，见图5。颜色深浅表示不同的强度，从红色到蓝色，表示强度从高到低。结果显示，不同组别的个体均能很好地聚集在各自的组别中，说明这26 个差异代谢物能够将4 组完全区分。

图5 各组大鼠结肠组织差异代谢物热图

3.4.4 最终差异代谢物筛选及代谢通路分析 首先筛选出正常组与模型组之间的差异代谢物，在此基础上观察美沙拉嗪和朝夕互补方对这些代谢物的影响。朝夕互补方对脾肾阳虚型溃疡性结肠炎相关的17 个代谢物有改善作用（P＜0.05，P＜0.01），代谢物信息详见表4。将17 个差异代谢标志物进行MetPA 分析，得到14 条代谢通路（P＜0.05），其中嘌呤代谢（0.200）、氨基糖和核苷酸糖代谢（0.121）2 条代谢通路的影响值大于0.1，可作为主要代谢通路，见图6。

图6 差异代谢物MetPA 通路分析

表4 各组大鼠结肠组织差异代谢物比较（，n＝7）

表4 各组大鼠结肠组织差异代谢物比较（，n＝7）

注：与模型组比较，∗P＜0.05，∗∗P＜0.01。

4 讨论

本实验采用基于LC⁃QTOF⁃MS 的代谢组学方法探讨参苓白术散与肾气丸“朝夕互补”对脾肾阳虚型溃疡性结肠炎大鼠的作用机制。朝夕互补方可使紊乱的代谢谱向正常的趋势回归，筛选出17 个与脾肾阳虚型溃疡性结肠炎相关的差异代谢物，涉及14 条代谢通路，可部分揭示朝夕互补方的作用机制。

4.1 氨基酸代谢 色氨酸是一种在免疫调节过程中起关键作用的氨基酸，在巨噬细胞内通过犬尿氨酸途径生成3⁃羟基邻氨基苯甲酸［13］。模型组大鼠3⁃羟基邻氨基苯甲酸含量升高，显示机体色氨酸代谢紊乱；经朝夕互补方干预后下调，提示其可能通过纠正色氨酸代谢紊乱以减轻溃疡性结肠炎大鼠炎症反应。N6⁃乙酰⁃L⁃赖氨酸是赖氨酸降解的中间产物，N⁃α⁃乙酰赖氨酸是赖氨酸与乙酰辅酶A 进行乙酰化的中间代谢物［14］。赖氨酸作为一种

必须氨基酸，具有促进机体发育，提高免疫功能的作用。赖氨酸乙酰化调节巨噬细胞中代谢酶的活性、稳定性以及控制炎症因子的产生从而调节炎症反应［15］。模型组N6⁃乙酰⁃L⁃赖氨酸、N⁃α⁃乙酰赖氨酸含量升高；经朝夕互补方干预后下调，提示其可能通过调节赖氨酸代谢发挥抗炎作用。

4.2 嘌呤代谢 鸟苷是一种以鸟嘌呤为基础的细胞外信号分子，可提高髓过氧化物酶活性以发挥抗炎和抗氧化作用［16］。肌苷酸是磷酸鸟苷的胞内前体，通过代谢肌苷发挥作用［17］。研究表明，肌苷对TNBS 诱导的大鼠结肠炎可通过促进尿酸生成发挥抗炎作用［18］。模型组鸟苷、肌苷酸和磷酸鸟苷含量升高；经朝夕互补方干预后下调，提示其可能通过干预嘌呤代谢促进尿酸生成发挥抗炎、抗氧化作用。

4.3 脂类代谢 胞磷胆碱是内源性合成磷脂酰胆碱的中间体，参与细胞膜的形成和修复［19］。3⁃羟甲基戊二酸是胆固醇代谢的中间产物［20］。胆固醇参与维持细胞膜的通透性和流动性以及跨膜信号通路的调节［21］。模型组胞磷胆碱、3⁃羟甲基戊二酸含量升高，可能由于溃疡性结肠炎结肠组织抗氧化能力下降，细胞释放活性氧与活性氮破坏细胞膜的稳定性［18］；经朝夕互补方干预后下调，提示其可能通过干预胆固醇代谢，修复细胞膜，维持细胞膜的稳定性以改善结肠黏膜损伤。甘油酸是甘油氧化产物，能促进内源性前列腺素的合成，增加黏膜血流量，增强胃肠平滑肌收缩［22］。模型组甘油酸含量降低；经朝夕互补方干预后上调，提示其可能通过促进甘油氧化，增加黏膜血流量以促进溃疡愈合，增强胃肠平滑肌收缩，促进胃肠蠕动以减轻大鼠腹胀。

4.4 能量代谢 尿苷二磷酸葡萄糖和尿苷二磷酸半乳糖是基于尿苷二磷酸的2 个己糖变体，可分解代谢ATP 为机体提供能量［23］。十二烷二酸是一种含12 个碳原子的饱和脂肪族二元酸，能为ATP 合成提供中间底物，且能量密度较高，可作为肠外营养的替代燃料底物之一［24⁃26］。上述代谢物在模型组中含量升高，与溃疡性结肠炎炎症部位新陈代谢增加需要消耗大量能量相符；经朝夕互补方干预后恢复至正常水平，提示其可能通过纠正能量代谢紊乱以改善结肠组织炎症反应。

4.5 维生素代谢及其他 泛酸（维生素B5）具有促进代谢和抗氧化的作用，参与辅酶A 合成，高度依赖辅酶A 的结肠组织在泛酸缺乏时易造成细胞损伤［27］。β⁃胍基丙酸是肌酸类似物，能够提高机体内线粒体酶活性，改善线粒体功能，提高抗氧化能力［28］。本研究发现，经朝夕互补方干预后，可上调泛酸和β⁃胍基丙酸，提示其可能通过干预维生素代谢，促进辅酶A 合成，增强抗氧化能力以减轻炎症。

综上所述，参苓白术散与肾气丸“朝夕互补”可改善脾肾阳虚型溃疡性结肠炎大鼠的宏观体征，减轻结肠炎症，促进溃疡愈合，联合结肠组织代谢组学发现其差异代谢物主要参与氨基酸代谢、氧化应激反应及能量代谢等。