三叶青地上部分提取物对H22 荷瘤小鼠的抗转移作用

王碧旭 卢静静孙棱程雯 周芳美 朱炳祺 丁志山∗

（1.浙江中医药大学医学技术与信息工程学院， 浙江 杭州310053； 2.浙江中医药大学生命科学学院，浙江 杭州310053）

肝癌作为全球最常见的的十大恶性肿瘤之一，其发病率与死亡率常年位居前列，全球约59%的新发病例分布于我国各地［1］。肝癌具有异质性强、潜伏期长、预后差等特点，大部分患者均于晚期被确诊且发生远端转移，致其迅速死亡［2⁃3］。目前，肝移植、肝切除及血管介入等为常规治疗方法，但易致患者预后不良［4⁃6］。中药可通过多靶点、多环节发挥抗肿瘤作用，且毒副作用较小。三叶青Tetrastigma hemsleyanumDiels et Gilg 为我国特有的葡萄科崖爬藤属珍稀药用植物，其全草均可入药，具有抗肿瘤、保肝护肺、调节免疫等药理作用［7⁃10］，于2018 年被列为新“浙八味”。本研究旨在探讨三叶青地上部分抗肝癌作用，筛选出其抗肿瘤主要药效成分，以期为三叶青的进一步深入开发利用提供实验依据。

1 材料

1.1 动物 SPF 级BALB／c 雄性小鼠100只，体质量20～24 g，由上海斯莱克实验动物有限责任公司提供，实验动物生产许可证号SCXK（沪）2017⁃0005。

1.2 细胞株 小鼠肝癌H22 细胞株由浙江中医药大学实验动物中心提供。

1.3 试剂与药物 三叶青地上部分均采自浙江省杭州市富阳区，经浙江中医药大学丁志山教授鉴定为正品。注射用环磷酰胺（德国 Baxter Oncology GmbH 公司，批 号7J196G）；TNF⁃α 试剂盒、IL⁃6 试剂盒、IFN⁃γ 试剂盒（上海信帆生物科技有限公司，批号 20160627158、20160612056、20160302016）；IL⁃2 试剂盒（江苏酶免实业有限公司，批号MM⁃43631M1）。其他试剂均为分析纯。

1.4 仪器 冻干机（美国Labconco 公司，型号FreeZone 4.5）；体式显微镜（日本尼康公司，型号SMZ25）；恒温CO2培养箱（美国Thermo Fisher 公司，型号Series ⅡWater Jacket）；微孔板酶标仪（美国BioTek 公司，型号Epoch2）。

2 方法

2.1 三叶青地上部分提取物的制备

2.1.1 三叶青地上部分醇提物 取适量干燥的三叶青地上部分打粉，过60 目筛，按料液比1∶15，加入95%乙醇冷凝回流2次，每次1.5 h，合并2 次滤液，旋转蒸发至无乙醇味，制得醇提物，备用，收集滤渣。

2.1.2 三叶青地上部分多糖 取“2.1.1”项下滤渣按照料液比1∶15 加入双蒸水，冷凝回流提取2次，每次1.5 h，减压过滤，合并2 次滤液，旋转蒸发，采用Sevag法去除蛋白部分，重复2次，旋转蒸发除去有机试剂，减压浓缩，缓慢加入3 倍体积95% 乙醇，充分混匀，静置12 h，4 000 r／min离心10 min，收集沉淀，用无水乙醇反复洗脱沉淀2次，抽滤去除乙醇，将沉淀真空冷冻干燥后制得粗多糖组分，备用。

2.2 H22 荷瘤小鼠模型的建立 H22 细胞按常规方法培养后，取健康小鼠腹腔注射肝癌细胞悬液0.2 mL，1 周后小鼠腹部膨隆，无菌条件下抽取小鼠腹水，用无菌生理盐水反复离心洗涤，调整细胞密度为1×108／mL，取0.05 mL 瘤细胞悬液接种于除空白组外其余小鼠左后肢爪垫内侧皮下。

2.3 分组及给药 将小鼠随机分为空白组，模型组，玉米油组，环磷酰胺组（40 mg／kg），醇提物低、中、高剂量组（50、100、200 mg／kg），多糖低、中、高剂量组（50、100、200 mg／kg），每组10 只。环磷酰胺组作为阳性对照组，玉米油组作为阴性对照组；醇提物各剂量组小鼠灌胃给予用玉米油溶解的三叶青地上部分醇提物；多糖各剂量组小鼠灌胃给予用无菌生理盐水溶解的三叶青地上部分多糖；环磷酰胺组小鼠隔天腹腔注射环磷酰胺；空白组、模型组小鼠灌胃给予等体积生理盐水；玉米油组小鼠灌胃给予等体积玉米油，每天1次，连续给药21 d。

2.4 小鼠抑瘤率和脏器指数检测 各组小鼠末次给药后禁食24 h，脱颈处死，剥离瘤块、脾脏、胸腺、肝脏组织，称定质量并计算抑瘤率和脏器指数，公式为抑瘤率＝［（模型组平均瘤质量－给药组平均瘤质量）／模型组平均瘤质量］ ×100%，脏器指数＝脏器平均质量／体质量×100%。

2.5 小鼠肿瘤远端转移灶检测 剥离各组小鼠肺组织、右侧腘窝、髂动脉旁、肾门处的淋巴结，用Bouin 液固定，48 h 后在体式显微镜下观察各组小鼠肿瘤远端转移灶，并记录转移灶数。

2.6 ELISA 法检测小鼠血清TNF⁃α、IL⁃6、IL⁃2、IFN⁃γ 水平 各组小鼠末次给药后禁食24 h，摘眼球取血并处死，收集血液，3 000 r／min 离心10 min，分离得血清，严格按照相关试剂盒说明书操作，检测小鼠血清TNF⁃α、IL⁃6、IL⁃2、IFN⁃γ 水平。

2.7 HE 染色观察小鼠肿瘤组织病理学变化 取各组小鼠剥离的瘤块于4%中性甲醛溶液中固定，石蜡包埋，切片，HE 染色，在显微镜下观察各组小鼠肿瘤组织病理学改变。

2.8 统计学分析 通过SPSS 17.0 软件、Graphpad Prism 5.0 软件进行处理，数据以（）表示，多组间比较采用单因素方差分析。P＜0.05 表示差异具有统计学意义。

3 结果

3.1 三叶青地上部分提取物对小鼠肿瘤生长的影响 与模型组、玉米油组比较，醇提物低剂量组小鼠瘤质量、瘤体积降低（P＜0.05），多糖各剂量组小鼠瘤质量、瘤体积降低（P＜0.05，P＜0.01），并呈剂量依赖性，见表1、图1。

图1 三叶青地上部分提取物对小鼠肿瘤生长的影响（，n＝10）

表1 三叶青地上部分提取物对小鼠肿瘤生长的影响（n ＝10）

3.2 三叶青地上部分提取物对小鼠脏器指数的影响 与空白组比较，模型组小鼠脾脏、肝脏指数升高（P＜0.05），胸腺指数无明显变化（P＞0.05）；与模型组比较，玉米油组小鼠脾脏指数降低（P＜0.05），多糖各剂量组小鼠胸腺指数升高（P＜0.05），肝脏指数降低（P＜0.05），环磷酰胺组小鼠脾脏、胸腺指数均降低（P＜0.05，P＜0.01）；与玉米油组比较，醇提物各剂量组小鼠各脏器指数均无明显变化（P＞0.05）；与环磷酰胺组比较，多糖各剂量组和醇提物各剂量组小鼠胸腺指数升高（P＜0.01），见图2。

图2 三叶青地上部分提取物对小鼠脏器指数的影响（，n＝10）

3.3 三叶青地上部分提取物对小鼠肿瘤远端转移的影响 小鼠经21 d 生长后，模型组小鼠肿瘤远端肺转移、淋巴道转移情况严重，肺表面与淋巴结表面均出现不同级别的圆形小突起转移结节。与模型组比较，环磷酰胺组和多糖各剂量组小鼠肺、淋巴道转移灶数减少（P＜0.05，P＜0.01）；与玉米油组比较，醇提物低、中剂量组小鼠肺转移灶数减少（P＜0.05，P＜0.01），见 图3～4。

图3 各组小鼠远端肺（A，×6.3）、淋巴道（B，×12.6）转移图

图4 三叶青地上部分提取物对H22 荷瘤小鼠肿瘤远端肺、淋巴道转移的影响（，n＝10）

3.4 三叶青地上部分提取物对小鼠血清TNF⁃α、IL⁃2、IFN⁃γ 水平的影响 与空白组比较，模型组、玉米油组小鼠血清TNF⁃α、IL⁃2、IFN⁃γ 水平降低（P＜0.05）；与模型组比较，多糖低剂量组小鼠血清IL⁃2 水平升高（P＜0.05），多糖中剂量组小鼠血清TNF⁃α、IL⁃2、IL⁃6 水平升高（P＜0.05，P＜0.01），多糖高剂量组小鼠血清TNF⁃α、IL⁃2、IL⁃6、IFN⁃γ 水平升高（P＜0.01），环磷酰胺组小鼠血清TNF⁃α、IFN⁃γ 水平升高（P＜0.05）；与玉米油组比较，醇提物低剂量组小鼠血清TNF⁃α、IL⁃2 水平升高（P＜0.05）；与环磷酰胺组比较，多糖低剂量组小鼠血清IL⁃6 水平升高（P＜0.05），多糖中剂量组小鼠血清IL⁃2、IL⁃6 水平升高（P＜0.01），多糖高剂量组小鼠血清TNF⁃α、IL⁃2、IL⁃6、IFN⁃γ水平升高（P＜0.05，P＜0.01），见图5。

图5 三叶青地上部分提取物对小鼠血清TNF⁃α、IL⁃2、IL⁃6、IFN⁃γ 水平的影响（，n＝10）

3.5 三叶青地上部分提取物对小鼠肿瘤组织病理学的影响 模型组、玉米油组小鼠H22 肿瘤细胞排列紊乱、大小不一，细胞核清晰可见，生长旺盛且部分细胞呈侵袭性生长；环磷酰胺组小鼠肿瘤组织内部细胞生长受抑制且呈不规则变形，细胞数明显减少；多糖各剂量组和醇提物各剂量组小鼠肿瘤细胞排列疏松，可见一定的细胞碎片和肿瘤细胞坏死区域，特别是多糖组肿瘤细胞坏死现象更为明显，见图6。

图6 各组小鼠肿瘤组织病理HE 染色图（×200）

4 讨论

肝癌具有转移速度快、恶性程度高、预后不良等特点，是我国肿瘤致死的第二大“元凶”［11⁃12］。迄今为止，放化疗联合应用仍然是治疗肝癌最常用的方法，但其易导致患者机体乏力、骨髓抑制及局部皮肤损伤，亦能损伤机体免疫功能。三叶青作为临床常用抗肿瘤药物，含有多种药用活性成分，前期对三叶青的研究多围绕块根及其醇提物类化合物抗肿瘤作用展开［13⁃15］，鲜有关于三叶青地上部分药理作用的研究。然而，临床上三叶青地上部分和块根同样使用，用药方式为水煎服，水溶性成分中含量最高的为多糖，因此推测多糖是三叶青重要的药效物质。

本研究通过建立H22 荷瘤小鼠模型，旨在探究三叶青地上部分各组分抗转移作用。在小鼠整个肿瘤生长周期，多糖各剂量组小鼠肿瘤生长得到抑制，最高抑瘤率可达43.07%。郭菁菁等［16］研究发现，三叶青多糖可有效减少乳腺癌小鼠远端肺转移，抑制肿瘤细胞的转移性，从而发挥抗肿瘤作用。本研究发现，与模型组比较，多糖各剂量组H22 荷瘤小鼠肿瘤远端肺和淋巴道转移均得到抑制，提示三叶青地上部分多糖可有效抑制肿瘤远端转移。环磷酰胺作为临床广泛使用的一种抗肿瘤药物，药效显著，但极易导致机体免疫功能下降。与模型组比较，环磷酰胺组小鼠胸腺指数降低，而多糖各剂量组小鼠胸腺指数升高，提示多糖对免疫器官具有一定的保护作用。同时，肿瘤组织病理学结果显示，三叶青地上部分多糖可显著促进肿瘤细胞坏死。

细胞因子在恶性肿瘤发生、发展过程中至关重要，TNF⁃α、白细胞介素、IFN⁃γ 均能激活机体免疫应答，在抗肿瘤方面承担着重要角色［17］。本研究发现，模型组小鼠血清TNF⁃α、IL⁃2、IFN⁃γ 水平低于空白组（P＜0.05）；而多糖组小鼠血清TNF⁃α、IL⁃2、IL⁃6、IFN⁃γ 水平高于模型组（P＜0.05，P＜0.01），说明三叶青地上部分多糖可通过调节机体相关细胞因子水平而增强免疫功能。

综上所述，本研究发现三叶青地上部分多糖具有良好的抗转移作用，其可能是通过调节机体免疫应答、抑制肿瘤远端转移和促进肿瘤细胞坏死而发挥抑制肿瘤生长和抗转移的作用。本研究初步证实三叶青地上部分具有与三叶青地下部分相同的抗肿瘤作用，为三叶青资源的开发利用奠定基础，对三叶青的临床应用与治疗具有一定的指导意义。