滋肾育胎丸联合二甲双胍对肾虚型多囊卵巢综合征大鼠的改善作用

何嘉仑 吴晓贞 张毅靖 甘剑峰 唐洪梅∗

（1.广州中医药大学第一附属医院， 广东 广州510405； 2.广州中医药大学， 广东 广州510405）

多囊卵巢综合征（polycystic ovarian syndrome，PCOS）是以长期无排卵、高雄激素血症、和／或胰岛素抵抗为基本特征，具有发病多因性、生理病理和临床表现多态性［1］，是导致育龄妇女月经异常、不孕的内分泌代谢紊乱性疾病，而高雄激素血症是育龄期女性最常见的内分泌疾病［2］。PCOS 是妇科临床疑难病证，影响约10% 育龄妇女［3］，属中医“闭经”“不孕”“癥瘕”等范畴［4］。滋肾育胎丸是著名中医学家罗元恺教授的经验方，对肾虚型PCOS 不孕患者具有改善中医证候及激素水平，提高促排卵效果及妊娠率的作用［5］。滋肾育胎丸治疗PCOS 常与二甲双胍联合用药，而二甲双胍作为PCOS 治疗的辅助用药可改善肥胖、多毛等症状，在改善高胰岛素血症的同时，降低女性体内的高雄激素，促进优势卵泡发育及排出［6⁃7］。本研究通过探讨滋肾育胎丸联合二甲双胍对肾虚型PCOS 大鼠模型的作用，及其对血管内皮生长因子（VEGF）及高迁移率族蛋白1（HMGB1）信号通路的影响，以期为深入探讨滋肾育胎丸治疗肾虚型PCOS 不孕患者的机理提供实验依据。

1 材料

1.1 动物 50 只SPF 级SD 雌性大鼠，6 周龄，体质量120～140 g，由广东省医学实验动物中心提供，实验动物生产许可证号SCXK（粤）2018⁃0002。

1.2 试剂与药物 滋肾育胎丸（批号A01007），购自广州白云山中一药业有限公司。盐酸二甲双胍肠溶胶囊（批号20012021），购自北京圣永制药有限公司；来曲唑片（批号191107 KG），购自江苏恒瑞医药股份有限公司；大鼠孕酮（P）、雌二醇（E2）、促黄体激素（LH）、睾酮（T）、血管内皮细胞生长因子（VEGF）ELISA 试剂盒（批号GR2020⁃07），均购自武汉基因美生物科技有限公司；高迁移率族蛋白（HMGB1）抗体、晚期糖基化终产物受体（RAGE）抗体（批号GR3216146⁃2、GR3274230⁃2），均购自艾博抗（上海）贸易有限公司。

1.3 仪器 5810R 型台式离心机，德国Eppendorf 公司；DG5033A 型多功能酶标仪，南京华东电子集团有限公司；Nikon Eclipse Ti⁃SR 型倒置荧光显微镜，日本尼康公司；165⁃8001 型垂直板电泳槽，海门其林贝尔仪器制造有限公司。

2 方法

2.1 造模 50 只SD 大鼠按照随机数字表法随机分为空白组10只，造模组40只，造模组大鼠灌胃给予0.5 mg／kg 来曲唑建立PCOS 模型，空白组大鼠灌胃给予蒸馏水，连续21 d，并在光学显微镜下观察大鼠一个动情周期的阴道涂片。

2.2 析因设计方案与分组处理 选取滋肾育胎丸（A）与二甲双胍（B）2 个实验因素，每个因素取2 个水平（1 不使用，2 使用），将2 个因素2 个水平进行组合，见表1。大鼠造模成功后，按照随机数字表法分为模型组（A1B1）、二甲双胍组（A1B2，150 mg／kg）、滋肾育胎丸组（A2B1，1.5 g／kg）、联合用药组（A2B2，150 mg／kg 二甲双胍＋1.5 g／kg滋肾育胎丸），每组10只，灌胃给予相应剂量药物，每天1次，连续28 d。

表1 2×2 析因设计

2.3 检测指标

2.3.1 卵巢形态学观察 给药结束后，各组大鼠禁食12 h，次日腹腔注射10%水合氯醛，麻醉后腹主动脉取血，迅速摘取双侧卵巢及子宫，取卵巢固定于4%甲醛溶液中，常规石蜡切片，HE 染色，显微镜下观察组织形态变化。

2.3.2 ELISA 法检测血清性激素P、E2、LH、T 及子宫匀浆液VEGF 水平 血样常温放置30 min，4 ℃、3 000 r／min离心5 min，取上层血清保存待测，按照试剂盒说明书检测血清性激素P、E2、LH、T 水平，以及一侧子宫匀浆液VEGF 水平。

2.3.3 Western blot 法检测子宫组织中HMGB1、RAGE 蛋白表达 子宫组织充分剪碎后加入裂解液，冰浴30 min，4 ℃、12 000 r／min 离心20 min，收集上清，BCA 法检测蛋白浓度，取40 μg 蛋白上样，电泳，转膜，5%脱脂牛奶封闭2 h，TBST 洗脱，一抗4 ℃孵育过夜，TBST 洗脱，二抗室温孵育2 h，化学发光法显色，将胶片进行扫描存档，用Image J 软件分析目标条带的光密度值。

2.4 统计学分析 通过SPSS 26.0 软件进行处理，数据以（）表示，如果服从正态分布且同时满足方差齐的条件，则组间比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用LSD 检验，而药物之间的交互作用采用析因设计方差分析；如果不服从正态分布，或者服从正态分布但方差不齐，则组间比较采用非参数检验，进一步成对比较采用Kruskal⁃Wallis H检验。P＜0.05 表示差异具有统计学意义。

3 结果

3.1 动情周期监测 空白组存在规律的动情周期；模型组使用来曲唑诱导21 d后，大鼠动情周期失去规律性变化，均处于动情间期，细胞总数较为稀少，以白细胞为主，偶见一些有核上皮细胞，见图1。

图1 大鼠阴道涂片（×20）

3.2 滋肾育胎丸及二甲双胍对PCOS 大鼠卵巢形态学的影响 空白组大鼠卵巢可见不同发育时期的初级卵泡、次级卵泡、成熟卵泡，卵泡内颗粒细胞层较厚且致密；模型组大鼠卵巢闭锁卵泡较空白组增多，囊状扩张明显增加，颗粒细胞层数减少（←处）；二甲双胍组、滋肾育胎丸组和联合用药组大鼠卵巢囊性扩张卵泡的数目明显减少，卵巢局部形态与空白组大致接近，见图2。

3.3 滋肾育胎丸及二甲双胍对PCOS 大鼠血清性激素及子宫匀浆液VEGF 水平的影响

3.3.1 单因素方差分析 与空白组比较，模型组血清P 水平降低（P＜0.05），血清LH、T 水平及子宫匀浆液VEGF水平升高（P＜0.05），E2水平无明显变化（P＞0.05）；与模型组比较，二甲双胍组、滋肾育胎丸组和联合用药组P水平均升高（P＜0.05），血清LH、T 水平及子宫匀浆液VEGF 水平均降低（P＜0.05），滋肾育胎丸组和联合用药组E2水平升高（P＜0.05），见表2。

表2 各组大鼠血清性激素及子宫匀浆液VEGF 水平比较（，n＝10）

表2 各组大鼠血清性激素及子宫匀浆液VEGF 水平比较（，n＝10）

注：与空白组比较，∗P＜0.05；与模型组比较，＃P＜0.05。

3.3.2 主效应与交互作用分析 根据析因设计方差分析的主体间效应比较来判断滋肾育胎丸与二甲双胍对于血清性激素及子宫匀浆液VEGF 水平是否存在交互作用。两药均有升高血清P 水平、降低血清T 水平的作用，但没有交互作用（P＞0.05）；滋肾育胎丸有升高血清E2水平的作用，而二甲双胍作用不明显，两药之间不存在交互作用（P＞0.05）；两药均有降低血清LH 水平、子宫匀浆液VEGF水平的作用，且两药之间存在交互作用（P＜0.05），见图3。

图3 各检测指标轮廓图

3.4 滋肾育胎丸及二甲双胍对PCOS 大鼠子宫组织中HMGB1、RAGE 蛋白表达的影响 与空白组比较，模型组大鼠子宫组织中HMGB1、RAGE 蛋白表达升高（P＜0.05）；与模型组比较，二甲双胍组、滋肾育胎丸组和联合用药组大鼠子宫组织中HMGB1、RAGE 蛋白表达降低（P＜0.05），见表3、图4。

图4 各组大鼠子宫组织HMGB1、RAGE 蛋白条带图

表3 各组大鼠子宫组织HMGB1、RAGE 蛋白表达比较（，n＝10）

表3 各组大鼠子宫组织HMGB1、RAGE 蛋白表达比较（，n＝10）

注：与空白组比较，∗P＜0.05；与模型组比较，＃P＜0.05。

4 讨论

现代研究表明，PCOS 患者血清LH 水平的异常增高引起雄性激素卵巢T 反馈性增加，而E2水平相对不足，引起高雄激素血症，抑制卵巢正常发育与排卵［8］。PCOS 患者下丘脑⁃垂体⁃卵巢功能轴的失调可致使E2和P 缺乏调控，ER、PR 表达异常导致VEGF 及其受体VEGFR2 的过度表达，促使Akt 磷酸化，从而导致子宫内膜形成过度增殖的状态以及上皮⁃间质异常转化，干扰胚胎正常着床导致PCOS 患者的流产或不孕［9⁃12］。来曲唑与脱氢表雄酮这2 种药物诱导造模的大鼠血清性激素均有改变，但脱氢表雄酮造模由于持续给予雄激素而难以区分内源性和外源性因素［13］，为了避免实验受到干扰，本研究采用来曲唑法［14］建立肾虚型PCOS 大鼠模型。目前认为PCOS 多起病于青春期，成年PCOS 是青春期PCOS 的延续［15］，因此本研究选择6 周龄大鼠。实验结果显示，模型组大鼠处于动情间期且性激素紊乱，卵巢组织病理切片具有明显多囊样改变，表明该模型基本符合临床肾虚型PCOS 不孕患者的病理改变。

中医认为PCOS 发病主要与肾⁃天癸⁃冲任⁃胞宫轴功能紊乱有关，涉及肾、肝、脾三脏，其中肾虚为根本病机［16］，而通过辨证施治可改善内源性激素分泌，达到调经、促孕的效果［4］。滋肾育胎丸方中菟丝子安胎补肾，人参大补元气；续断、桑寄生、盐巴戟天、杜仲可辅助菟丝子益肾气、补肾阳；白术、党参辅助人参健脾补气；艾叶止血温经，砂仁调中理气；枸杞子、熟地黄、阿胶、制何首乌养血滋阴；鹿角霜补元阳、生精髓，全方共奏健脾益肾、固元益气之功［17］。本研究结果表明，滋肾育胎丸可升高E2、P 水平，降低LH、T 水平，抑制VEGF 过表达，对于肾虚型PCOS 大鼠，与二甲双胍联合用药比单一用药疗效更佳。滋肾育胎丸治疗后大鼠血清E2水平升高可能是来源于补足的气血精微，以促进优势卵泡的发育。

滋肾育胎丸与二甲双胍对降低LH 和VEGF 具有交互作用，可能与其作用的靶点相同有关。HMGB1 与VEGF 蛋白的过表达有密切关系，高表达HMGB1 可直接作用于血管内皮细胞或间接作用于巨噬细胞上的受体，上调NF⁃κB，促进VEGF 生成［18］。本研究推测滋肾育胎丸联合二甲双胍对VEGF 过表达的治疗作用可能与抑制HMGB1 信号通路活性有关，实验结果显示，滋肾育胎丸与二甲双胍均可通过降低子宫组织HMGB1 及其配体RAGE 的表达，达到抑制VEGF 过表达的目的，这可能是滋肾育胎丸联合二甲双胍治疗肾虚型PCOS 的作用机制之一。