金铁锁提取物对类风湿性关节炎小鼠滑膜组织自噬与凋亡的研究

韦迎春 钱子刚 普元柱崔萌 周兴悦 郭荣伶 陈海丰

（云南中医药大学， 云南 昆明650500）

类风湿性关节炎是一种慢性自身免疫性疾病，主要病理特征为炎症反应、滑膜增生、关节软骨和骨破坏等［1］，全球发病率达1%［2］。研究表明，自噬在机体中的失衡与类风湿性关节炎息息相关［3］。一般情况下，自噬作为机体的保护机制可减轻抗原微生物、异常蛋白等产生的危害，但有研究发现，在类风湿性关节炎患者的滑膜细胞中存在高水平自噬，从而导致滑膜细胞抗凋亡，异常增殖的滑膜细胞侵袭软骨及骨组织导致持续炎症和关节损伤［4］。因此，降低滑膜细胞的自噬水平将是研究类风湿性关节炎治疗机制的重要方向。

中医根据类风湿性关节炎的病因病机将其归属于“痹症”范畴，治疗原则为祛风除湿，散寒止痛［5］。石竹科植物金铁锁首载于《滇南本草》，具有祛风除湿、散瘀止痛、解毒消肿之功，作用于风湿痹痛，跌打损伤等病症［6］，临床上金铁锁在许多具有消炎止痛功效的中成药中发挥重要作用［7］。现代药理研究发现，金铁锁治疗类风湿性关节炎的机制可能与其抗炎镇痛、调节免疫的作用有关［8］。本研究将通过探究金铁锁提取物对胶原诱导的关节炎小鼠滑膜组织中细胞自噬与细胞凋亡的影响，为金铁锁治疗类风湿性关节炎的作用机制提供新的实验依据。

1 材料

1.1 动物 100 只清洁级雄性C57BL／6 小鼠，7～8 周龄，体质量15～18 g，购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司，实验动物生产许可证号SCXK（湘）2019⁃0004。小鼠饲养于云南中医药大学动物实验中心，实验动物使用许可证号SYXK（滇）2017⁃0005，小鼠适应性饲养7 d 后开始实验。本实验经云南中医药大学动物实验中心伦理委员会审查合格（编号R⁃06202043）。

1.2 试剂与药物 金铁锁，购自云南绿生中草药开发有限公司，经云南中医药大学杨竹雅副教授鉴定为石竹科植物金铁锁Psammosilene tunicoidesW.C.Wu et C.Y.Wu 的干燥根。硫酸羟氯喹片（自噬抑制剂，批号191070）购自上海上药中西制药有限公司；鸡Ⅱ型胶原（批号190463）、弗氏完全佐剂（批号200262）均购自美国Chondrex 公司；caspase⁃3 多克隆抗体（批号20657⁃1⁃AP）、LC3 多克隆抗体（批号14600⁃1⁃AP）、Beclin⁃1 多克隆抗体（批号11306⁃1⁃AP）、P62／SQSTM1 多克隆抗体（批号18420⁃1⁃AP）、β⁃actin 单克隆抗体（批号66009⁃1⁃lg）、GAPDH 单克隆抗体（批号66004⁃1⁃lg）、辣根过氧化物酶（HRP）标记的山羊抗兔IgG二抗（批号SA00001⁃2）、辣根过氧化物 酶（HRP）标记的山羊抗鼠IgG 二抗（批号SA00001⁃1）均购自美国Proteintech 公司；BCA 蛋白浓度测定试剂盒（批号P0010）购自上海碧云天生物技术有限公司。

1.3 仪器 Axio Vert.A1 型倒置显微镜购自德国蔡司公司；DYY⁃6D 型电泳仪购自北京六一生物科技有限公司；Chemstud 型多功能分子凝胶成像系统购自德国耶拿公司；组织高速冷冻匀浆机购自武汉赛维尔生物科技有限公司；Spark10M 型酶标仪购自帝肯（上海）贸易有限公司；SW⁃CJ⁃1D 型超净工作台购自上海昕仪仪器仪表有限公司；Neofuge 15R 型高速冷冻离心机购自力康生物医疗科技控股有限公司。

2 方法

2.1 金铁锁提取物制备 称取适量金铁锁干燥粉末，加5倍量75%乙醇回流提取3次，滤过，合并滤液，浓缩，回收乙醇，即得金铁锁提取物，出膏率为0.387 9%。给药前用生理盐水稀释至低、高剂量（75.65、302.60 mg／kg），相当于临床等效剂量、4 倍剂量。

2.2 造模、分组及给药 每只小鼠尾根部皮下注射0.1 mL鸡Ⅱ型胶原与完全弗氏佐剂等比混合乳剂（每0.1 mL 含100 μg 胶原），记为首次免疫，首次免疫第21天，以相同方法进行二次加强免疫［9⁃10］。二次免疫后第16天，将造模成功的小鼠随机分为模型组、羟氯喹组（52 mg／kg）及金铁锁低、高剂量组（75.65、302.60 mg／kg），每组10只，另取未造模的10 只小鼠作为正常组。分组后当天开始给药，给药组灌胃给予相应剂量药物，正常组和模型组灌胃给予等量生理盐水，连续21 d。

2.3 小鼠关节炎损伤程度评价

2.3.1 关节炎指数评分 致炎后，每隔3 d 对小鼠后肢进行关节炎评分，记录关节炎病变程度。评分标准［11］为0分，无明显红肿；1分，踝、腕关节或单个足趾轻度红肿；2分，踝或腕关节中度红肿；3分，整个足包括足趾严重红肿；4分，四肢严重发炎，多关节受累病变。

2.3.2 足肿胀度检测 使用排水容积法测量各组小鼠左右后足足跖容积，以小鼠造模前后足跖容积差度指示小鼠足跖的炎症程度。足肿胀率＝［（致炎后足跖平均容积⁃致炎前足跖平均容积）／致炎前足跖平均容积］ ×100%。

2.3.3 关节病理组织学检查 将右后肢标本在10%中性福尔马林中固定24 h，经EDTA 脱钙后包埋在石蜡中，切成5 μm厚的组织切片，进行HE 及番红O⁃固绿染色，在100倍光学显微镜下观察关节组织病理变化。

2.4 TUNEL 法检测小鼠关节组织细胞凋亡情况 组织切片转移至二甲苯中脱蜡，并在乙醇中水化，然后用50 μL蛋白酶⁃K 溶液覆盖样品，室温下培养15～30 min，根据试剂盒说明书进行TUNEL 染色，于在高倍镜下（×400）对至少有100 个细胞的3 个随机视野进行观察，计算TUNEL阳性细胞的百分比。

2.5 Western blot 法检测小鼠滑膜组织中自噬和凋亡相关蛋白表达 称取适量小鼠滑膜组织，加RIPA 裂解液进行匀浆，提取总蛋白，蛋白定量后加样，恒压电泳，湿转法转膜，含5%脱脂奶粉的封闭液室温封闭2 h，TBST 洗涤，加入一抗4 ℃孵育过夜，TBST 洗涤，加入二抗（辣根过氧化物酶标记）室温孵育2 h，TBST 洗涤，加入ECL 化学发光显影液显色，暗室曝光，拍照，使用Image J 软件对图像的灰度值进行分析。

2.6 免疫荧光共聚焦检测LC3、p62 蛋白表达 制备小鼠关节切片，待切片干燥，滴加破膜工作液，室温放置20 min，PBS 洗涤，滴加3%牛血清蛋白封闭液，室温封闭30 min，甩掉封闭液，滴加PBST 稀释的一抗，于湿盒中4 ℃孵育过夜，PBST 洗涤，滴加荧光标记二抗，室温避光孵育60 min，PBST 洗涤，滴加DAPI 染液复染核，室温避光孵育15 min，PBST 洗涤，稍甩干玻片，滴加抗荧光淬灭封片液封片，于光学显微镜下观察LC3、p62 蛋白荧光强度。

2.7 统计学分析 通过GraphPad Prism 8.0.2 软件进行处理，数据以（）表示，组间比较采用单因素方差分析。P＜0.05 表示差异具有统计学意义。

3 结果

3.1 金铁锁提取物对胶原诱导的关节炎小鼠关节炎指数评分的影响 二次免疫后，小鼠的踝关节、足跖多关节逐渐出现明显红肿，16 d 时模型组小鼠关节炎指数评分均大于4分，表明造模成功［12］，且正常组小鼠均无关节炎症状。如表1 所示，除正常组外，各组小鼠关节炎指数评分逐渐升高，在21 d 达到峰值后开始降低。与模型组比较，29 d后羟氯喹组关节炎指数评分降低（P＜0.01），33 d 后金铁锁各剂量组和羟氯喹组关节炎指数评分均降低（P＜0.01）。

表1 金铁锁提取物对胶原诱导的关节炎小鼠关节炎指数评分的影响（分，，n＝10）

表1 金铁锁提取物对胶原诱导的关节炎小鼠关节炎指数评分的影响（分，，n＝10）

注：与正常组比较，＃＃P＜0.01；与模型组比较，∗∗P＜0.01。

3.2 金铁锁提取物对胶原诱导的关节炎小鼠足肿胀的影响 二次免疫当日测量小鼠左右后足足跖容积作为致炎前足跖容积，致炎前各组小鼠足跖容积比较无差异（P＞0.05）。实验期间正常组小鼠足跖容积未发生明显变化（P＞0.05），提示正常组小鼠未出现足肿胀病变。与正常组比较，16 d 后模型组小鼠足肿胀度升高（P＜0.05，P＜0.01）；与模型组比较，金铁锁高剂量组给予药物干预21 d 后抑制了小鼠足肿胀度（P＜0.05，P＜0.01），33 d 后金铁锁各剂量组和羟氯喹组小鼠足肿胀度降低（P＜0.01），见表2。

表2 金铁锁提取物对胶原诱导的关节炎小鼠左右后足足肿胀度的影响（%，，n＝10）

3.3 金铁锁提取物对胶原诱导的关节炎小鼠关节病理组织学损伤程度的影响 如图1 所示，正常组小鼠关节面平滑，软骨及骨组织无明显损伤，无明显炎性细胞浸润；模型组小鼠关节组织滑膜成纤维细胞增生，滑膜组织增厚，炎性细胞浸润较为严重，关节面出现明显损伤导致关节面不平滑，软骨细胞（红色）明显增加，符合类风湿性关节炎的基本病理学特征，表明胶原诱导的关节炎小鼠模型造模成功；金铁锁各剂量组小鼠关节组织炎性细胞浸润明显减少，正常组增加但较模型组减少。提示，金铁锁提取物对小鼠关节及软骨有一定的保护作用，可有效缓解类风湿性关节炎病症。

图1 各组小鼠关节组织切片病理变化（×100）

3.4 金铁锁提取物对胶原诱导的关节炎小鼠关节滑膜组织细胞凋亡的影响 如图2 所示，与正常组比较，模型组小鼠关节滑膜组织中滑膜细胞阳性染色（棕色）细胞减少；与模型组比较，羟氯喹组小鼠关节滑膜细胞凋亡阳性率增加（P＜0.05），金铁锁各剂量组小鼠关节滑膜细胞凋亡阳性率增加，但差异无统计学意义（P＞0.05）。提示，模型小鼠关节滑膜细胞凋亡受到抑制，而药物干预后细胞凋亡增加。

图2 金铁锁提取物对胶原诱导的关节炎小鼠滑膜组织细胞凋亡的影响（，n＝10）

3.5 金铁锁提取物对胶原诱导的关节炎小鼠滑膜组织中自噬及凋亡相关蛋白表达的影响 与正常组比较，模型组小鼠滑膜组织Beclin⁃1、Bcl⁃2 蛋白表达和LC3Ⅱ／LC3Ⅰ比值升高（P＜0.05，P＜0.01），p62、caspase⁃3 蛋白表达降低（P＜0.05）；与模型组比较，羟氯喹组和金铁锁高剂量组小鼠滑膜组织Beclin⁃1 蛋白表达降低（P＜0.05），caspase⁃3 蛋白表达升高，但差异无统计学意义（P＞0.05），金铁锁各剂量组p62 蛋白表达升高（P＜0.05），金铁锁高剂量组Bcl⁃2 蛋白表达降低（P＜0.05），见图3。

图3 金铁锁对胶原诱导的关节炎小鼠滑膜组织中自噬及凋亡相关蛋白表达的影响（，n＝10）

3.6 金铁锁提取物对胶原诱导的关节炎小鼠滑膜组织中LC3、p62 蛋白表达的影响 如图4 所示，与正常组比较，模型组小鼠滑膜组织LC3 蛋白表达增加（P＜0.05），而p62蛋白表达减少（P＜0.05）；与模型组比较，羟氯喹组和金铁锁各剂量组小鼠滑膜组织LC3、p62 荧光强度均增强（P＜0.05），提示小鼠滑膜组织中LC3 与p62 蛋白表达增加。

图4 金铁锁提取物对胶原诱导的关节炎小鼠滑膜组织中LC3、p62 蛋白表达的影响（，n＝10）

4 讨论

在类风湿性关节炎的发病机制中，滑膜细胞的持续异常增殖与滑膜组织增厚、持续炎症等密切相关。因此，促进滑膜细胞凋亡成为研究类风湿性关节炎治疗机制的关键途径之一［13］。本研究发现，金铁锁提取物干预后小鼠滑膜组织细胞凋亡增加，滑膜增生、软骨损伤与炎性细胞浸润等情况得到改善。

越来越多研究表明，自噬在类风湿性关节炎的发病过程中不仅参与了炎症反应，对细胞凋亡也具有一定的调控作用，是重要的作用靶点之一［14⁃16］。当自噬被激活，上游信号启动，磷酸化自噬标志蛋白Beclin⁃1 诱导细胞自噬的发生［17］。Beclin⁃1 激活后，从Beclin⁃1／Bcl⁃2复合物中分离，重新形成Beclin⁃1／VPS34 复合物促进自噬体的形成［18⁃19］。本研究发现，金铁锁提取物有效抑制了小鼠滑膜组织中Beclin⁃1 和Bcl⁃2 蛋白表达，上调了caspase⁃3 蛋白表达。提示，金铁锁提取物可能通过靶向Beclin⁃1／Bcl⁃2 复合物，干扰Beclin⁃1 与Bcl⁃2 的相互作用，抑制自噬体的形成，对自噬和凋亡起到调控作用。

在自噬体形成后期，LC3 被Atg4 切割，LC3Ⅰ转化为LC3Ⅱ后定位到自噬体膜上。LC3Ⅱ可以稳定标示自噬小体的形成，是最常用的自噬特异性标志物，自噬体成熟后与溶酶体结合，进一步降解其内容物，因此，常以LC3Ⅱ／LC3Ⅰ比值与自噬底物p62 表达共同指示自噬通量［20］。通常LC3Ⅱ／LC3Ⅰ上调提示自噬小体形成增加，自噬的降解伴随着p62 表达的下降。如果自噬溶酶体降解受到抑制，也会导致p62 的积累［21⁃22］，自噬抑制剂羟氯喹正是通过阻断自噬体的降解抑制自噬［23］。本实验结果显示，金铁锁提取物可能发挥着类似于羟氯喹的作用，通过抑制自噬体的降解，降低自噬水平，从而改善小鼠关节炎症。有研究表明，自噬⁃溶酶体途径和泛素⁃蛋白酶体途径共同担负着细胞内降解错误折叠蛋白的职责，当其中一条途径受到抑制，另一条途径活性会代偿性增加，以维持机体内平衡［24⁃25］。因此，金铁锁提取物对自噬⁃溶酶体途径的影响是否也影响着泛素⁃蛋白酶体途径，还需要进一步实验证明。

综上所述，本实验证实金铁锁提取物治疗类风湿性关节炎的药效机制可能是通过抑制自噬体的形成，抑制自噬体降解，下调自噬水平，同时促进滑膜组织中细胞凋亡，从而改善滑膜异常增生及滑膜增生引起的炎症及软骨损伤。