心宝丸质量标准的提高

吴丽琼 林琼英 庄伟洪 蔡荣钦

（广东心宝药业科技有限公司， 广东 广州510535）

心宝丸是由洋金花、人参、肉桂、附子、鹿茸、冰片、人工麝香、三七、蟾酥9 味药材组成的中药制剂，临床上广泛用于病态窦房结综合征、慢性心功能不全、心肌缺血、心率失常等心脏疾病的治疗，效果显著，不良反应少，深受医师和患者认可［1］，近年来研究发现，该制剂联合西药治疗慢性心力衰竭合并心动过缓时具有理想疗效［2⁃8］，并且临床上辅以综合护理［9］或联用功能相近的中成药时也能提高药物临床疗效［10⁃11］，在社会老龄化趋势下其市场潜力和应用前景突出。然而，现阶段心宝丸执行标准仅设置【性状】、【鉴别】、【检查】 等质量控制项目，缺少含量测定项，而且随着2020 年版《中国药典》对相关药材质控要求的提高，上述标准部分鉴别项相对滞后，专属性差，无法对该制剂质量进行有效控制［12⁃14］，亟待提高。

国家食品药品监督管理局数据库信息显示，心宝丸共有2 个国药准字，即Z44021843（广东心宝药业科技有限公司）、Z44022728（广东太安堂药业股份有限公司），故本实验以上述2 家公司产品为研究对象，通过TLC、GC、HPLC 法进行定性鉴别和含量测定，以期为该制剂质量标准提高提供参考。

1 材料

GC⁃2014 气相色谱仪（配置氢火焰离子检测器）、LC⁃20AT 高效液相色谱仪（日本岛津公司）；Agilent 1260 高效液相色谱仪，配置Agilent Open LAB 色谱工作站（版本号2.1.0）（美国Agilent 公司）；AL204、MS105DU、ME303电子分析天平（瑞士梅特勒⁃托利多公司）；HNY⁃350 L 超声波清洗器（华南超声设备有限公司）。聚乙二醇（PEG⁃20M）Rtx®⁃Wax 毛细管柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；Phenomenex Gemini C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；中普红RD⁃C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；Agilent EC⁃C18色谱柱（150 mm×4.6 mm，4 μm）。预制硅胶G 薄层板（青岛海洋化工有限公司、德国Macherey⁃Nagel 公司）；硅胶G 薄层板（自制）。乙腈为色谱纯；其他试剂均为分析纯；水为超纯水。

硫酸阿托品（批号100040⁃200510）、氢溴酸东莨菪碱（批号100049⁃201009）、龙脑（批号110881⁃201508）、麝香酮（批号110719⁃201215）、桂皮醛（批号110710⁃201720）、人参皂苷Rg1（批号110703⁃201731）、人参皂苷Re（批号110754⁃201626）、人参皂苷Rb1（批号110704⁃201726）对照品及洋金花对照药材（批号121058⁃200503）（中国食品药品检定研究院）。洋金花、冰片、肉桂、人工麝香阴性样品（批号20191217）及人参、三七阴性样品（批号20171217）（广东心宝药业科技有限公司）。心宝丸（批号20180301、20180501、20190702、20190901、20190902、20190903、20190904、20190905、20190907、20190908，用于TLC 定性鉴别；批号20171004、20180301、20180501、20190701、20190702、20190901、20190902、20190903、20190904、20190907，用于GC 定性鉴别；批号20160101、20160803、20160909、20161009、20170405、20170810、20171004、20171005、20171006、20180301，用于HPLC 含量测定，均由广东心宝药业科技有限公司生产。批号C20170105、C20170712、C20171104、C20180104、C20180501、C20180901、C20181202、C20190101、C20190607、C20191216，用于TLC、GC 定性鉴别；批号C20180203、C20180602、C20181108、C20190204、C20190602、C20190801、C20191008、C2002003、C2005052、C2005053，用于HPLC 含量测定，均由广东太安堂药业股份有限公司生产）。

2 方法与结果

2.1 定性鉴别

2.1.1 TLC 法（洋金花）

2.1.1.1 供试品溶液制备 取本品2 g，研细，加乙酸乙酯⁃无水乙醇⁃氨水（100∶5∶1）25 mL，超声（400 W、40 kHz）处理30 min，滤过，滤液蒸干，加1 mL 甲醇溶解，即得。

2.1.1.2 对照药材溶液制备 取洋金花对照药材1 g，加乙酸乙酯⁃无水乙醇⁃氨 水（100∶5∶1）25 mL，超 声（400 W、40 kHz）处理30 min，滤过，滤液蒸干，加1 mL甲醇溶解，即得。

2.1.1.3 对照品溶液制备 取硫酸阿托品、氢溴酸东莨菪碱对照品适量，加甲醇制成每1 mL 含两者各4 mg 的溶液，即得。

2.1.1.4 阴性样品溶液制备 取缺洋金花的阴性样品2 g，按“2.1.1.2”项下方法制备，即得。

2.1.1.5 结果分析 吸取对照药材溶液5 μL，对照品溶液各1 μL，供试品、阴性样品溶液各10 μL，分别点于同一硅胶G 薄层板上，以乙酸乙酯⁃甲醇⁃氨水（17∶2∶1）为展开剂，展开后取出，晾干，于日光下检视，结果见图1。由此可知，供试品溶液在对照药材、对照品溶液相应位置上显相同颜色斑点，阴性无干扰，表明该方法专属性良好。

图1 2 家公司洋金花TLC 色谱图

2.1.2 GC 法（冰片、人工麝香、肉桂）

2.1.2.1 色谱条件与系统适应性考察 聚乙二醇（PEG⁃20M）Rtx® ⁃Wax 毛细管柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；程序升温（初始80 ℃，保持5 min，以5 ℃／min 升至180 ℃，保持10 min）；进样口温度210 ℃；检测器温度250 ℃；分流比10∶1；载气体积流量1.59 mL／min。理论塔板数按龙脑峰计，应不低于10 000。

2.1.2.2 对照品溶液制备 精密称取龙脑、麝香酮、桂皮醛对照品适量，加乙酸乙酯制成每1 mL 分别含三者0.1、0.02、0.1 mg 的溶液，即得。

2.1.2.3 供试品溶液制备 取本品适量，研磨后取细粉约5 g，精密称定，置于具塞锥形瓶中，精密加入乙酸乙酯20 mL，称定质量，超声（400 W、40 kHz）处理10 min，取出，放冷，乙酸乙酯补足减失的质量，摇匀，滤过，即得。

2.1.2.4 阴性样品溶液制备 取缺冰片、肉桂、人工麝香的阴性样品，按“2.1.2.3”项下方法制备，即得。

2.1.2.5 结果分析 精密量取对照品、供试品溶液各1 μL，在“2.1.2.1”项色谱条件下进样测定，结果见图2。由此可知，供试品溶液呈现与对照品溶液保留时间一致的色谱峰，阴性无干扰，表明该方法专属性良好。

图2 各成分GC 色谱图

2.2 HPLC 含量测定（人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1）

2.2.1 色谱条件与系统适应性考察 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流动相乙腈（A）⁃水（B），梯度洗脱，程序见表1；体积流量1.0 mL／min；检测波长203 nm。理论塔板数按人参皂苷Rg1计，应不低于6 000。

表1 梯度洗脱程序

2.2.2 对照品溶液制备 精密称取人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1对照品适量，甲醇制成每1 mL 分别含三者0.6、0.15、0.7 mg 的溶液，摇匀，即得。

2.2.3 供试品溶液制备 取本品适量，研细后取约1 g，精密称定，置于具塞锥形瓶中，精密加入水饱和的正丁醇50 mL，称定质量，加热回流提取1.5 h，放冷，水饱和正丁醇补足减失的质量，摇匀，滤过。精密量取续滤液20 mL，置于蒸发皿中蒸干，残渣加50%甲醇溶解，转移至10 mL 量瓶中，50% 甲醇稀释至刻度，滤过，取续滤液，即得。

2.2.4 阴性样品溶液制备 取缺人参、三七的阴性样品，按“2.2.3”项下方法制备，即得。

2.2.5 方法学考察

2.2.5.1 线性关系考察 精密称取各对照品适量，甲醇溶解并制成每1 mL 分别含人参皂苷Rg1190.4、380.8、565.3、775.9、992.1 μg，人参皂苷 Re 51.1、99.8、149.8、199.7、234.9 μg，人参皂苷Rb1370.6、605.8、785.4、975.1、1 179.5 μg 的溶液，在“2.2.1”项色谱条件下各进样10 μL 测定。以对照品峰面积为纵坐标（Y），进样量为横坐标（X）进行回归，结果见表2。由此可知，各人参皂苷在各自范围内呈良好的线性关系。

表2 各人参皂苷线性关系

2.2.5.2 专属性试验 吸取对照品、供试品、阴性样品溶液各10 μL，在“2.2.1”项色谱条件下进样测定，结果见图3。由此可知，阴性无干扰，表明该方法专属性良好。

图3 各人参皂苷HPLC 色谱图

2.2.5.3 精密度试验 取“2.2.2”项下对照品溶液适量，在“2.2.1”项色谱条件下进样测定6次，测得人参皂苷Rg1、人 参皂苷Re、人参皂 苷Rb1峰面积RSD 分别为0.5%、0.6%、0.5%，表明仪器精密度良好。

2.2.5.4 重复性试验 取本品（批号20170905）6份，每份约1 g，精密称定，按“2.2.3”项下方法制备供试品溶液，在“2.2.1”项色谱条件下进样测定，测得人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1含量RSD 分别为0.5%、0、0.3%，表明该方法重复性良好。

2.2.5.5 稳定性试验 取本品（批号20170905）适量，按“2.2.3”项下方法制备供试品溶液，于0、8、16、24、36、48 h在“2.2.1”项色谱条件下进样测定，测得人参皂苷Rg1、人 参皂苷Re、人参皂 苷Rb1峰面积RSD 分别为0.4%、0.5%、1.3%，表明溶液在48 h 内稳定性良好。

2.2.5.6 加样回收率试验 精密称取同一批本品（批号20170405，含人参皂苷Rg10.761 mg／丸、人参皂苷Re 0.172 mg／丸、人参皂苷Rb10.777 mg／丸）9份，置于具塞锥形瓶中，每3 份1组，分别精密加入50%水平（含人参皂苷Rg10.059 mg／mL、人参皂苷Re 0.013 mg／mL、人参皂苷Rb10.061 mg／mL）、100%水平（含人参皂苷Rg10.120 mg／mL、人参皂苷Re 0.027 mg／mL、人参皂苷Rb10.121 mg／mL）、150%水平（含人参皂苷Rg10.189 mg／mL、人参皂苷Re 0.040 mg／mL、人参皂苷Rb10.182 mg／mL）对照品溶液（溶剂为水饱和正丁醇）各50 mL，称定质量，加热回流提取1.5 h，放冷，水饱和正丁醇补足减失的质量，摇匀，滤过，精密量取续滤液20 mL，置于蒸发皿中蒸干，残渣加50%甲醇溶解，转移至10 mL 量瓶中，50% 甲醇稀释至刻度，滤过，取续滤液，在“2.2.1”项色谱条件下进样测定，计算回收率，结果见表3。

表3 各人参皂苷加样回收试验结果（n＝9）

2.2.5.7 色谱柱考察 取本品（批号20180301）适量，按“2.2.3”项下方法制备供试品溶液，分别采用Phenomenex Gemini C18（250 mm× 4.6 mm，5 μm）、中普红RD⁃C18（250 mm × 4.6 mm，5 μm）、Agilent EC⁃C18（150 mm ×4.6 mm，4 μm）色谱柱，在“2.2.1”项色谱条件下进样测定。结果，人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1分离度良好，三者含量RSD 分别为0.5%、4.4%、4.5%，表明不同色谱柱对测定无明显影响。

2.2.5.8 仪器考察 取本品（批号20170905）适量，按“2.2.3”项下方法制备供试品溶液，在Phenomenex Gemini C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）上分别采用LC⁃20AT、Agilent 1260 高效液相色谱仪，在“2.2.1”项色谱条件下进样测定。结果，人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1分离度良好，三者含量RSD 分别为0、2.2%、1.9%，表明不同仪器对测定无明显影响。

2.2.6 样品含量测定 取20 批样品，按“2.2.3”项下方法制备供试品溶液，在“2.2.1”项色谱条件下进样测定，计算人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1总含量，结果见表4。

表4 人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1 总含量测定结果

3 讨论

3.1 显微鉴别 本实验对心宝丸原标准中的显微鉴别项进行药材归属，发现三七为树脂道碎片含黄色油滴状或块状分泌物；鹿茸为不规则碎块灰黄色，稍具光泽，充塞灰黑色微细颗粒。

3.2 GC 定性鉴别 心宝丸原标准中的部分鉴别项存在一定缺陷，如升华法鉴别冰片时因温度难以控制，导致结果重复性差；TLC 法鉴别人工麝香、鹿茸时，由于2020 年版《中国药典》中指标成分更新，存在阴性干扰现象。本实验建立的GC 法专属性强，可对冰片、人工麝香进行定性鉴别。

3.3 检测波长选择 本实验采用DAD 检测器对对照品溶液进行全波长扫描，发现当检测波长为203 nm时，各人参皂苷色谱图基线平稳，具有良好的紫外吸收，峰形稳定，杂质干扰小，分离度较好。

3.4 供试品溶液制备方法筛选 本实验考察了提取溶剂（水饱和正丁醇、70%甲醇、50%甲醇）、提取方法（回流、超声）、提取时间（15、30、45、60、90、120 min）、取样量（1.0、3.0 g）对各人参皂苷提取率的影响，最终确定为“2.2.3”项下方法，此时提取效果最好。

3.5 含量限度制定 研究表明，人参皂苷具有抗氧化、改善血流动力学、调节血管功能、抗血栓形成、保护心肌缺血再灌注等药理活性，对多种心血管疾病都有着显著的治疗作用［15⁃16］，而三七、人参作为心宝丸主要药味，富含人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1等活性成分［17⁃19］，其中人参是贵重药材，不同厂家在制备过程中其投料差异在很大程度上影响到产品质量，故有必要制定该类成分含量限度，以保证产品有效性。本实验测定2 个厂家各10 批心宝丸中人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1总含量，以其平均值的70%为下限来制订限度，最终确定每丸含人参、三七以三者总含量计，不得少于1.0 mg。

4 结论

心血管疾病作为全球发病率和致死率最高的疾病之一，严重威胁人类生命健康。心宝丸作为治疗多种心血管疾病的名优产品，是在补肾壮阳药基础上加益气、活血、通络等药物形成特色组方，不仅表现出高效低毒的优势特征，而且联合其他中西药物使用能增强疗效，在社会老龄化趋势下具有广阔的应用前景，但该制剂组方药材多，也在一定程度上增加了其质量控制的难度。现行心宝丸标准大多采用传统手段，存在阴性干扰、重复性差等问题，而且缺少含量测定项，不利于产品质量控制。本实验基于2020 年版《中国药典》对心宝丸药材指标成分的更新，建立TLC法定性鉴别洋金花，GC 法定性鉴别冰片、人工麝香、肉桂，HPLC 测定人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1总含量，大大提高了该制剂质量的安全性和可控性，从而为建立其更全面的质量标准提供有力保证。