鹿红方颗粒提取工艺的优化

李素丽 曹岚岚周泉程雪梅杨涛周华∗王长虹∗

（1.上海中医药大学中药研究所， 上海市复方中药重点实验室， 中药标准化教育部重点实验室， 上海201203； 2.上海中医药大学附属曙光医院中西医结合心血管病研究所， 上海201203）

鹿红方是具有治疗慢性心力衰竭作用的验方，由鹿角、红花、淫羊藿、补骨脂、山茱萸、女贞子、沉香7 味药材组成［1⁃2］，以传统水煎剂形式应用于临床，存在使用不便等缺点。因此，有必要将鹿红方研制成固体剂型（如颗粒剂等），以便临床使用。

在中药复方提取工艺综合评价过程中，多重评价指标权重系数合理性会对结果会产生较大影响，计算权重的方法一般分为主观赋权法、客观赋权法，并且大多采用多指标评价体系权重赋分［3］，其中G1 法是对层次分析法进行改进的主观赋权法，具有计算速度快、无需一致性检验等优点［4］；熵权法作为客观赋权法可与其他方法组合使用［5］。课题组前期建立了鹿红方水煎剂中羟基红花黄色素A、没食子酸、沉香四醇、马钱苷、异补骨脂苷、补骨脂苷、特女贞苷7 种主要活性成分含量的测定方法［6］，本实验采用星点设计⁃响应面法结合G1⁃熵权法优化鹿红方颗粒提取工艺，以期为该制剂临床合理应用提供参考。

1 材料

Agilent 1100 高效液相色谱 仪（美国 Agilent Technologies 公司）；BT25S（十万分之一）、BSA124S⁃CW（万分之一）电子分析天平（德国赛多利斯公司）；DRT⁃TW 电热套（郑州长城科工贸有限公司）。羟基红花黄色素A（批号AF9081601）、异补骨脂苷（批号AF9102108）、补骨脂苷（批号AF9102107）、马钱苷（批号AF7110703）对照品均购于上海鸿永生物科技有限公司，纯度均大于98%；特女贞苷（批号2018011201）对照品购于成都普利斯生物科技有限公司，纯度大于98%；没食子酸（批号DST190715⁃008）、沉香四醇（批号DST190801⁃042）对照品均购于成都乐美天医药科技有限公司，纯度均大于98%。鹿角、红花、淫羊藿、补骨脂、女贞子、山茱萸、沉香饮片均购于上海康桥中药饮片有限公司，经上海中药标准化研究中心吴立宏研究员鉴定为正品。甲酸为色谱纯（批号G0960200，上海安谱科学仪器有限公司）；乙腈为色谱纯（美国Thermo 公司）；其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 参考文献［6］ 报道，ZORBAX SB⁃Aq 色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相乙腈⁃0.1% 磷酸，梯度洗脱（0～10 min，5% 乙腈；10～15 min，5%～10%乙腈；15～35 min，10%～18%乙腈；35～40 min，18%～25%乙腈；40～60 min，25%～35%乙腈）；体积流量1.0 mL／min；柱 温30 ℃；检测波长230 nm；进样量10 μL。

2.2 对照品溶液制备 精密称取羟基红花黄色素A、没食子酸、沉香四醇、马钱苷、异补骨脂苷、补骨脂苷、特女贞苷对照品适量，甲醇稀释定容至刻度，即得。

2.3 供试品溶液制备 按处方量取药材约125 g（鹿角15 g、红花9 g、淫羊藿30 g、补骨脂20 g、女贞子30 g、山萸肉15 g、沉香6 g），精密称定，采用Design⁃Expert 10.0 软件设计出的方案进行煎煮，滤过，滤液减压浓缩至1 000 mL，得到鹿红方水煎剂，取适量用0.45 μm 微孔滤膜过滤，取续滤液，即得。

2.4 评价指标组合赋权 依据功效相关物质及复方“君臣佐使”配伍原则，分别采用主观赋权（G1 法）、客观赋权（熵权法）对羟基红花黄色素A、没食子酸、沉香四醇、马钱苷、异补骨脂苷、特女贞苷、补骨脂苷含量及干浸膏得率进行组合赋权。

2.4.1 G1法参考文献［7⁃9］ 报道，具体步骤如下。

（1）确定各评价指标重要顺序，根据其相对于某评价准则的顺序关系，记为x1＞x2＞…＞xa［10］。

（2）根据重要程度之比进行理性赋值，将xk－1、xk重要性程度之比的相对重要程度记为rk［10］，即权重评价标度的理性判断，公式为rk＝ωk－1／ωk，k＝a，a－1，…，2。

（3）计算权重系数ωk［10］，公式为ωk ＝（1＋＝r2r3…rk＋r3r4…rk＋…＋rk。

结果，各评价指标重要性程度依次为羟基红花色素含量＞马钱苷含量＞补骨脂苷含量＝异补骨脂苷含量＝没食子酸含量＝特女贞苷含量＞浸膏得率含量＞沉香四醇含量，根据理性赋值将其权重评价标度定为r2＝1.1、r3＝1.5、r4＝1、r5＝1、r6＝1、r7＝1.4、r8＝1.3，主观权重分别为ω1＝0.196 2、ω2＝0.178 3、ω3＝0.118 8、ω4＝0.118 8、ω5＝0.118 8、ω6＝0.118 8、ω7＝0.084 9、ω8＝0.065 4。

2.4.2 熵权法 参考文献［7］ 报道，具体步骤如下。

（1）对原始数据矩阵归一化处理，原始矩阵为xij（其中有j个评价指标、i个评价对象），将其进行归一化处理，即rij＝（xij－xjmin）／（xjmax－xjmin），其中xij为第i个对象的第j项评价指标数据，xjmax、xjmin分别为xij的最大值、最小值，i＝1，2，…，b，j＝1，2，…，a［7］。

（2）根据特征比重求取指标熵值sj［11］，公式为sj ＝，其 中（当fij＝0时，xijlnb＝0）。

（3）计算指标权重系数ωj［11］，公式为ωj ＝（1－ sj）／

2.4.3 组合权重确定 以各评价指标主观权重为ω1，客观权重为ω2，计算组合权重ωj［7］，公式为ωj ＝，结合主客观赋权，得到组合权重值ω和综合评分Pj，公式为Pj＝ωa（100ωjxj）／ωjmax，再进行直观分析、方差分析［7］，结果见表1。

表1 各评价指标权重值

2.5 星点设计⁃响应面法 以加水量（A）、煎煮时间（B）为影响因素，羟基红花黄色素A、没食子酸、沉香四醇、异补骨脂苷、马钱苷、补骨脂苷、特女贞苷含量及浸膏得率为评价指标，计算综合评分（Y），因素水平见表2，结果见表3，方差分析见表4。

表2 因素水平

表3 试验设计与结果

采用Design⁃Expert 8.0.6 软件对表3 数据进行多元线性回归，得方程为Y＝94.58＋3.2A－0.062B＋0.75AB－1.20A2－2.03B2（r＝0.92、P＝0.007 6），可知该模型拟合度较好，误差较小，可用于预测，方差分析见表4，可知各因素影响程度依次为A＞B，其中A有显著影响（P＜0.01）。响应面分析见图1，最终确定最优工艺为加水量14倍，煎煮时间80 min，综合评分96.51 分。

图1 各因素响应面图

表4 方差分析

2.6 提取次数筛选 取处方量药材，在“2.3”项优化工艺下分别提取1、2、3次，计算综合评分，结果见表5。由此可知，提取2 次时综合评分已达到提取3 次时的94%，故从节约资源、本等角度考虑，最终确定提取次数为2 次。

表5 提取次数筛选结果

2.7 验证试验 按照优化工艺进行3 批验证试验［12］，结果见表6，可知该工艺合理可行，预测性、重复性均好。

表6 验证试验结果（n＝3）

3 讨论与结论

前期单因素试验结果表明，煎煮时间对鹿红方颗粒中各成分含量影响显著，为保证其提取，在工艺优化前将各药材均浸泡45 min。本实验在预试验、单因素试验基础上选择两因素三水平，即加水量10、12、14倍，煎煮时间0.5、1、2 h，而煎煮次数为非连续变量，与其他连续性变量之间存在一定的交互作用，故需单独考察。

常用的试验设计方法有均匀设计、正交试验设计等，但均存在模型预测性差、精度不够等缺点，并且取值往往只接近最佳值，而无法精确到最佳点，不能灵敏地对各因素之间的交互作用进行考察［13］。星点设计作为响应面法的一种设计方式，在遵循其基本原理［14］的同时适合考察指标与影响因素之间的非线性关系。本实验所采用的星点设计⁃响应面法可进行非线性的拟合，从而得到拟合度较高的最佳模型，并且具有精度高、试验次数少等特点，在药学领域中广泛应用［15］。

本实验选择羟基红花黄色素A、没食子酸、沉香四醇、马钱苷、异补骨脂苷、补骨脂苷、特女贞苷作为指标成分，其中羟基红花黄色素A、马钱苷、沉香四醇、特女贞苷与2020 年版《中国药典》相关标准一致，在四者转移到水煎液中的同时可对量质传递过程进行监控。另外，还对红景天苷、淫羊藿苷、补骨脂素、异补骨脂素进行指认，但其含量在水煎液中较低，对工艺无明显影响，故未纳入评价指标。

综上所述，本实验采用星点设计⁃响应面法结合G1⁃熵权法优化鹿红方颗粒提取工艺，其稳定可控，有效成分得率较高，可为该制剂工业化生产提供实验依据。