干蟾中蟾毒配基类成分含量动态变化规律

葛珈铭邓莎赵盈 迟凯文 李佳荣 李梦园 李先宽

（天津中医药大学， 天津301617）

干蟾为两栖纲蟾蜍属动物中华大蟾蜍Bufo bufo gargarizansCantor 或黑眶蟾蜍Bufo MelanostictusSchneider 除去内脏的干燥体，首载于 《本经逢原》［1］，性味辛凉，有毒，具有消肿解毒、利尿之功效，其水溶液制剂具有抗肿瘤、抗病毒、提高免疫力等作用［2⁃4］，临床上用于治疗带状疱疹、肺癌、肝癌、胃癌、恶性肿瘤等疾病［5⁃9］。目前，随着市场需求不断增加，蟾蜍在许多省份均有养殖，但并未形成规范统一的质量标准［10⁃11］，导致市场上干蟾皮质量参差不齐。本研究以刮浆后的干蟾为研究对象，对不同生长年限干蟾中华蟾酥毒基、脂蟾毒配基、蟾毒灵、蟾毒它灵4 种指标成分进行测定，旨在对不同生长年限的干蟾进行质量评价，并探究干蟾成分累积与生长年限等因素的关系，为干蟾的规范化生产，蟾蜍类药材资源高效利用提供依据。

1 材料

LC⁃20AT 型 HPLC 仪（日本岛津公司）；KH3200B 型数控超声波清洗器（江苏昆山超声仪器公司）；FA2004 万分之一电子天平（上海精天电子仪器有限公司）；Sartorius BT125D 十万分之一电子天平（德国赛多利斯公司）；循环水式多用真空泵（巩义市予华仪器有限责任公司）；RE⁃52AA旋转蒸发器（上海亚荣生化仪器厂）；KDM 型调温电热套（北京永兴精佳仪器有限公司）。

蟾毒灵、脂蟾毒配基、华蟾酥毒基对照品（中国食品药品检定研究院，批号111981⁃201501、110718⁃201108、110803⁃201406）；蟾毒它灵对照品（天津万象恒远科技有限公司，批号20180115）。乙腈（色谱纯）；甲醇（色谱纯）；磷酸二氢钾（分析纯，批号20141218）；磷酸（分析纯）；重蒸馏水。

4 批干蟾均购自吉林市昌邑区某蟾蜍养殖合作社，加工方式均为蟾蜍刮浆，腹部切开，剥取皮，保留头、足、骨骼，玻璃板上及时展开晾干，经天津中医药大学张坚副教授鉴定为中华大蟾蜍Bufo bufo gargarizansCantor 的干燥全体，见表1。

表1 样品信息Tab.1 Information of samples

2 方法与结果

2.1 色谱条件 Diamonsil C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流动相乙腈（A）⁃0.5%磷酸二氢钾（B），磷酸调节pH 为3.2，梯度洗脱（0～15 min，30%～61% B；15～30 min，61% B；30～32 min，30% B）；检测波长296 nm；体积流量0.7 mL／min；柱温30 ℃；进样量20 μL。

2.2 溶液制备

2.2.1 对照品溶液 分别取华蟾酥毒基、脂蟾毒配基、蟾毒灵、蟾毒它灵对照品适量，分别置于10 mL 量瓶中，甲醇稀释至刻度，分别制成蟾毒它灵0.051 3 mg／mL、蟾毒灵0.053 8 mg／mL、华蟾酥毒基0.085 0 mg／mL、脂蟾毒配基0.050 0 mg／mL 的溶液，即得。

2.2.2 供试品溶液 取干蟾皮药材粉末（过3 号筛），精密称定2.0 g，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25 mL，加热回流1 h，滤过，浓缩回收甲醇，用甲醇定容到5 mL，摇匀，过0.45 μm 微孔滤膜，取续滤液，即得。色谱图见图1。

图1 各成分HPLC 图Fig.1 HPLC spectrogram of various constituents

2.3 线性关系考察 精密吸取蟾毒它灵、蟾毒灵、华蟾酥毒基、脂蟾毒配基对照品，分别进样测定，记录峰面积，以各成分质量浓度为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y）进行回归，绘制标准曲线，见表2。

表2 各成分线性关系Tab.2 Linear relationships of various constituents

2.4 精密度试验 精密吸取4 种对照品溶液各20 μL，进样测定6次，测得蟾毒它灵、蟾毒灵、华蟾酥毒基、脂蟾毒配基对照品峰面积RSD 分别为0.53%、0.74%、0.81%、0.92%，表明仪器精密度良好。

2.5 稳定性试验 0～12 h 内每间隔2 h 分别进样1次，测得蟾毒它灵、蟾毒灵、华蟾酥毒基、脂蟾毒配基峰面积RSD 分别为1.64 %、1.47 %、0.68%、1.09 %，表明样品在12 h 内稳定性良好。

2.6 重复性试验 平行制备6 份样品，进样测定，测得蟾毒它灵、蟾毒灵、华蟾酥毒基、脂蟾毒配基峰面积RSD 分别为1.59%、2.35%、1.54%、1.68%，表明该方法重复性良好。

2.7 加样回收率试验 样品分成3 组（高、中、低质量浓度），每组2份，每份1 g，精密加入4 种对照品贮备液，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，吸取20 μL 进样测定，结果见表3。

表3 各成分加样回收率试验结果（n＝6）Tab.3 Results of recovery tests for various constituents（n＝6）

2.8 含量测定 称取一定量4 种不同年限的干蟾，精密称定，分3 次进样，测定药材中各成分含量，见表4、图2。

图2 蟾毒配基类成分含量百分比Fig.2 Percentage contents of bufogenin constituents

表4 各成分含量测定结果（mg／g）Tab.4 Results of content determination for various constituents（mg／g）

3 讨论

通过对干蟾的性状进行分析总结，干蟾随年份增长颜色加深、质量增大、耳后腺及皮脂腺数目增多且逐渐充盈。HPLC 法测定华蟾酥毒基、脂蟾毒配基、蟾毒灵、蟾毒它灵4 种指标成分含量，10年生与3 年生相比，分别下降70.1%、63.5%、64.1%、75.1%。干蟾中4 种蟾毒配基类成分含量呈逐年下降趋势，为3 年生＞5 年生＞8 年生＞10年生。

历代本草所述蟾蜍越大，痱磊越多，药效更强。这与本实验结果相悖，是由于干蟾中的化学成分随年份增长积累至痱磊中且古时蟾蜍用法多为活蟾剥取皮，不刮去痱磊中分泌物，而本研究对象为刮浆后的干蟾，结合刘美等［12］研究发现，蟾酥中的化学成分含量高于干蟾中化学成分含量，因此呈现成分含量随年限增长而逐年下降趋势。历代本草中记载蟾蜍皮主要用于治疗恶疮，其主要物质基础是蟾蜍毒素类成分［13］，而本研究测定的指标成分为蟾毒配基类成分，其细胞毒性较小，主要为强心作用［14］。

市场上干蟾炮制加工方式主要有2种，一种是刮浆后去除内脏、骨骼、肌肉纤维，另一种是刮浆后仅去除内脏。历代本草中记载［15⁃16］均以蟾蜍皮入药，现今市场为提高药材产量常见第二种炮制方式，依据本研究结果及罗毅［17］、周谧［11］等研究分析，保留骨骼、肌肉纤维会造成各成分比例变化，减缓干燥速率，导致微生物繁殖，造成干蟾菌检不合格，影响干蟾的临床疗效。

3 年生干蟾中蟾毒配基类成分含量最高，但为使蟾蜍类药材经济效益最大化，应综合考虑蟾蜍其他药用资源（干蟾、蟾衣、蟾酥）的效益，蟾酥中的蟾毒配基类成分含量远高于干蟾及蟾衣，且随年份增长，干蟾质量增大，因此干蟾应在蟾蜍生长8～10 年取尽蟾酥后采收为宜。