UPLC⁃MS／MS 法同时测定通窍耳聋丸中4 种成分

2022-12-03香栾雨毛飞

中成药 2022年11期

陈香栾雨毛飞

（1.镇江市食品药品监督检验中心，江苏镇江212003； 2.江苏大学医学院，江苏镇江212013）

突发性耳聋是指突然发生的、原因不明的感音神经性听力损伤，近年来其发病率有升高趋势，患者也有年轻化趋势［1⁃2］。通窍耳聋丸中含北柴胡、龙胆、黄芩、陈皮、芦荟、青黛、天南星（矾炙）、熟大黄、栀子（姜炙）、当归、木香、醋青皮，常用于治疗突发性耳聋，临床疗效确切，为2020 年版《中国药典》一部新增品种，该制剂制备工艺为饮片粉末入药，用水泛丸，干燥后以滑石粉包衣［3］。目前，通窍耳聋丸质量标准中的指标成分仅有龙胆苦苷、黄芩苷［4⁃6］，也尚无对黄芩苷、龙胆苦苷、橙皮苷、柴胡皂苷A 进行含量测定的报道，故本实验建立超高效液相色谱⁃串联质谱（UPLC⁃MS／MS）法［7⁃11］同时测定上述4 种成分的含量，以期为该制剂质量控制研究提供可靠的检测手段。

1 材料

1.1 仪器 KQ⁃118 型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；XRS205 型电子分析天平（瑞士Mettler⁃Toledo公司）；Omni Hubble C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；Shimadzu 8050 型超高效液相色谱⁃三重四极杆质谱仪，配置LC⁃MS⁃8040、MS⁃SPD⁃M20A 检测器（日本Shimadzu 公司）。

1.2 试剂与药物黄芩苷（批号110715⁃202122，纯度94.2%）、橙皮苷（批号110721⁃202019，纯度95.3%）、龙胆苦苷（批号110770⁃201918，纯度97.1%）、柴胡皂苷A（批号110777⁃201912，纯度94.8%）对照品均购自中国食品药品检定研究院。通窍耳聋丸分别购自吉林省天光药业有限公司（批号20200304、20200412、20200507）、长春人民药业集团有限公司（批号20191214、20200130、20200405）。甲酸、甲醇均为色谱纯（美国Tedia公司）；水为纯化水（Thermo Scientific Barnstead Genpure 纯化水系统制得）。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 Waters CORTECS T3 色谱柱（2.1 mm×100 mm，2.7 μm）；流动相水（A）⁃甲醇（B），梯度洗脱（0～10 min，67% A，33% B；10～19 min，40%A，60%B；19～19.01 min，20%A，80%B）；体积流量0.4 mL／min；柱温35 ℃；进样量1.0 μL。

2.2 质谱条件电喷雾离子源，正离子检测；多反应监测（MRM）模式；离子喷雾电压4.00 kV；鞘气20 arb；辅助气8 arb；加热模块温度350 ℃；DL 温度300 ℃；干燥气体积流量11.00 L／min；碰撞气体高纯氩气［2⁃4］，MRM 条件见表1。

表1 各成分MRM 条件Tab.1 MRM conditions of varioius constituents

2.3 供试品溶液制备取本品20粒，碾细，混合均匀，精密称取1.0 g，加入20 mL 甲醇，沸水浴加热回流1.5 h，室温冷却，转移到50 mL 量瓶中，甲醇定容至刻度，摇匀，0.45 μm 针头滤器过滤，弃去1 mL 初滤液，取续滤液，即得。

2.4 对照品溶液制备精密称取对照品柴胡皂苷A 10.12 mg、橙皮苷10.20 mg、龙胆苦苷10.04 mg、黄芩苷10.29 mg，甲醇溶解并定容至100 mL，作为贮备液，分别精密吸取10 mL，转移到100 mL量瓶中，甲醇稀释至刻度，制成质量浓度分别为10.04、10.12、10.20、10.29 μg／mL 的溶液，即得。再依次稀释2、5、8、10、20倍，在“2.1”“2.2”项条件下进样测定，MRM 图、总离子流图分别见图1～2。

图1 各成分MRM 色谱图Fig.1 MRM chromatograms of various constituents

2.5 线性关系考察取6 个质量浓度对照品溶液，在“2.1”“2.2”项条件下进样测定。以对照品峰面积（Y）对其质量浓度（X）进行回归，结果见表2，可知各成分在各自范围内线性关系良好。

表2 各成分线性关系Tab.2 Linear relationships of various constituents

2.6 定量限、检测限考察龙胆苦苷、柴胡皂苷A、橙皮苷、黄芩苷分别以特征分子离子峰m／z195.3、619.2、303.0、271.0 为监测离子对进行检测，在四者质量浓度为10.00 ng／mL 时信噪比（S／N）大于10，故选择其作为定量限；为4.00 ng／mL时（S／N）＞3，故选择其作为检测限。

2.7 精密度试验取对照品溶液适量，在“2.1”“2.2”项条件下进样测定6次，测得龙胆苦苷、柴胡皂苷A、橙皮苷、黄芩苷峰面积RSD 分别为1.0%、1.3%、1.2%、1.1%，表明仪器精密度良好。

2.8 稳定性试验取“2.3”项下供试品溶液，于0、2、4、8、12、16、24 h 在“2.1”“2.2”项条件下进样测定，测得黄芩苷、龙胆苦苷、橙皮苷、柴胡皂苷A 峰面积RSD 分别为1.35%、1.46%、1.28%、1.79%，表明溶液在24 h 内稳定性良好。

2.9 重复性试验精密称取本品（批号20200304）1.0 g，按“2.3”项下方法平行制备6 份供试品溶液，在“2.1”“2.2”项条件下进样测定，测得黄芩苷、龙胆苦苷、橙皮苷、柴胡皂苷A 含量RSD分别为0.34%、2.02%、0.85%、1.20%，表明该方法重复性良好。

2.10 加样回收率试验称取本品粉末0.5 g，加入对照品溶液，混匀，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，在“2.1”“2.2”项条件下进样测定，计算回收率，结果见表3。

图2 各成分总离子流图Fig.2 Total ion chromatograms of various constituents

表3 各成分加样回收率试验结果（n＝3）Tab.3 Results of recovery tests for various constituents（n＝3）

2.11 样品含量测定取6 批样品，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，在“2.1”“2.2”项条件下进样测定，计算含量，结果见表4。

表4 各成分含量测定结果（n＝3）Tab.4 Results of content determination of various constituents（n＝3）

3 讨论

3.1 指标成分确定通窍耳聋丸中北柴胡含柴胡皂苷A［12］，能保护肝脏，缓解神经损伤，具有良好的神经保护作用［13］；龙胆主要成分龙胆苦苷具有保肝、抗炎等功效，可用于治疗中耳炎［14⁃15］；黄芩及其主要成分黄芩苷可明显抑制模型小鼠耳廓的肿胀，具有体内抗炎作用［16］；陈皮、醋青皮中橙皮苷可抗菌、抗病毒、保护心血管等［17⁃18］，故本实验选择四者进行含量测定。

3.2 分析条件优化本实验分别采用甲醇⁃水、乙腈⁃水作为流动相，发现前者洗脱时有利于各成分质谱响应。再考察了流动相中加入改性剂对结果的影响，发现在水相中添加甲酸、乙酸、乙酸铵或三乙胺均有助于改善黄芩苷、橙皮苷峰形，但乙酸铵、三乙胺会抑制柴胡皂苷A 质谱信号强度，而甲酸灵敏度高于乙酸。然后，考察了不同体积分数（0.01%、0.02%、0.05%、0.1%、0.2%）甲酸，发现在0.05% 下各成分色谱峰峰形和分离度最理想。