S-三甲基-L-半胱氨酸对膀胱尿路上皮癌细胞Eg5基因表达和凋亡的影响

曹正国，田 超，钟苏权，周琳雄，陈桂柳

（汕头大学医学院附属粤北人民医院泌尿外二科，广东 韶关 512026）

膀胱尿路上皮癌是泌尿外科发病率最高的恶性上皮肿瘤，目前临床治疗以手术为主，但手术后容易复发和转移，对术后患者的预后、疗效及能否获得较好的生存预期有着重要的影响[1-2]。国内外较多的研究证实，膀胱尿路上皮癌是一种多基因肿瘤疾病，其发生发展是一个复杂、多步骤的过程，包括基因组不稳定性、原癌基因激活和抑癌基因失活、端粒酶的缺失等[3-4]。因此，在高转移潜能的膀胱肿瘤细胞上寻找一些具有能识别复发和进展风险的独特分子标志，可作为较敏感的标志物用于临床预后的评估和靶向治疗。细胞有丝分裂经历 G1期、S 期、G2 期和M 期，通过纺锤体的形成和运动，将复制染色体精确分配到两个子代细胞中，此过程需要纺锤体、多种微管相关蛋白和有丝分裂检查点蛋白的共同参与。有丝分裂纺锤体作为调控细胞有丝分裂活动的核心调控机制，是由驱动蛋白等多种功能蛋白质分子组装和维护的，这些蛋白质分子目前已成为抗肿瘤细胞增殖的有效靶标[5-6]。纺锤体驱动蛋白Eg5 是驱动蛋白家族成员之一，抑制Eg5 能引起细胞周期停滞进而导致细胞凋亡。既往的驱动蛋白抑制剂不仅对有丝分裂细胞的微管有亲和力，对轴突微管同样产生作用，长期使用此类药物会产生不可逆转的神经系统毒性、中性粒细胞减少症等诸多毒副作用，而S-三甲基-L-半胱氨酸（STLC）是2004 年新发现的有效抑制Eg5 的靶向药物[7-8]。目前有关Eg5 在膀胱肿瘤中作用的研究报道较少。为了研究STLC 抑制膀胱肿瘤与Eg5 的关系及靶向药物治疗的机制，我们分别采用流式细胞术、四甲基偶氮唑盐微量酶反应（MTT）比色法、TUNEL 染色法、逆转录- 聚合酶链反应（RT-PCR）和Western Blotting 法检测STLC 对体外培养的人膀胱尿路上皮癌BIU-87 细胞中Eg5 表达的影响。现报道如下。

1 材料与方法

1.1 主要材料

STLC（164739，Sigma 公司）；人膀胱尿路上皮癌BIU-87 细胞（武汉大学典型培养物宝藏中心）；四甲基偶氮唑蓝（MTT）（475989-1GM，Sigma 公司）；TUNEL试剂盒（C1098，碧云天生物有限公司）；Trizol 试剂（15596018，Gibcol 公司）；RT-PCR 试剂盒（KR123，TIANGEN 公司）；兔抗人Eg5 多克隆抗体（SC-365593，Santa Cruz 公司）；Western Blotting system 和ECL 发光试剂盒（RPN2236，Amersham 公司）。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养 将培养贴壁到对数生长期的BIU-87细胞以台盼蓝染色实验检测，当细胞活力达到95% 以上时，用无血清1640 培养液洗涤2 次，每孔滴加含5 μmol/L的STLC 共孵育再继续培养，观察时间点分别选取0 h、4 h、8 h、12 h、16 h 和24 h。

1.2.2 细胞周期阻滞的检测 收集上述不同时间段经STLC 处理的细胞，进行PI 染色，以流式细胞术对上述细胞进行细胞周期阻滞的检测和早期凋亡（亚二倍体峰）诱导分析。

1.2.3 细胞周期阻滞后可逆性恢复的检测 经STLC 与BIU-87 共孵育18 h 后，应用PBS 缓冲液轻轻冲洗细胞两次，去除STLC 药物后以1640 培养液继续培养，分别在不同时间（1 h、2 h、3 h、4 h、5 h 等）收集上述细胞，碘化丙啶染料染色后，以流式细胞术对上述细胞再次行细胞周期阻滞的检测和早期凋亡诱导分析。

1.2.4 MTT 比色法检测细胞增殖抑制率 收集STLC 共孵育24 h 的细胞（以下均同），并调节细胞浓度至1×104个/mL，接种在96 孔培养皿上，设空白对照组。每组细胞加入20 μL 的MTT 溶液，4 h 后加入100 μL 的二甲基亚砜，充分混匀，摇床低速震荡15 min，采用酶联免疫检测仪检测吸光度，计算细胞增殖抑制率，计算公式：细胞增殖抑制率=（A 空白对照组-A 实验组）/ A 空白对照组×100%。

1.2.5 TUNEL 染色实验检测细胞凋亡 在玻片上制备细胞爬片，加入4%多聚甲醛固定液，室温固定30 min，按照TUNEL 试剂盒说明书进行凋亡程序检测，并设置阴性对照，在放大倍数（×400）镜下可见棕褐色颗粒状着色的BIU-87 细胞核即为凋亡细胞，统计500 个细胞中凋亡细胞所占的百分比，即为凋亡指数。

1.2.6 RT-PCR 法 检 测Eg5 mRNA 的 相 对 表 达细胞总RNA 的提取参照Trizol 试剂使用说明书进行。 通过Primer 5.0 引物设计软件设定Eg5 引物：上 游5’-ATTTGGCGGCTCCGACTGGC -3’、 下 游5’-TGGGCGCTAGCTTTCCGCTC -3’ 和 内 参 基 因β-actin 引物：上游 5 ’- GACTGCCTGCCTCACTTT-3 ’、下 游 5’-GCTGATCTCGGCTTCTGT-3’。RNA 逆 转 录获取DNA 后，以两步法进行RT-PCR，将5 μL 体积的PCR 产物在1.5% 琼脂糖凝胶上进行电泳，将电泳条带在蛋白转膜仪凝胶成像系统中进行分析，通过Quantity One 软件计算灰度值，计算Eg5 与β-actin 的比值。

1.2.7 Western Blotting 法检测Eg5 蛋白的表达 以5:1比例将组织蛋白裂解液与细胞混匀，离心后取10 μL 上清液并以1:1 比例与上样缓冲液放入沸水中水浴、离心，再取上清液。将50 μg 总蛋白样品经SDS-PAGE 恒压电泳2 h，将电转化的蛋白转移至PVDF 膜，加入膜封闭液充分覆盖，室温振荡封闭2 h 后加入一抗4℃孵育过夜，加入二抗孵育PVDF 膜2 h，洗膜3 次，按照ECL和Western Blotting system 试剂盒方法进行显色，于扫膜仪下曝光、显影，计算光密度值。

1.3 统计学处理

采用统计软件SPSS 18.0 对数据进行分析。计量资料以±s表示，组间比较采用t检验；计数资料以%表示，组间比较采用χ² 检验；以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 STLC 诱导BIU-87 细胞周期阻滞和凋亡的情况

将STLC 与BIU-87 细胞共孵育，不同时间点收集细胞，可见随着STLC 作用时间延长至16 h，细胞有丝分裂周期中G2/M 期的BIU-87 细胞明显增多（29.6%），且细胞发生凋亡的比例也有明显增加的趋势。统计分析显示，与0 h 相比，STLC 处理16 h 时细胞凋亡比例升高，差异有统计学意义（χ²=5.409，P=0.020）。以上结果表明，STLC 在阻滞BIU-87 细胞周期进程的同时，可诱导其细胞发生凋亡。详见图1。

图1 STLC 在0 h、4 h、8 h、12 h、16 h 等不同时间对BIU-87 细胞周期和凋亡的影响

2.2 STLC 去除后对细胞有丝分裂周期的恢复及凋亡的影响

去除STLC 后再培养，于不同时间点收集细胞，结果表明STLC 去除后BIU-87 细胞周期进程开始恢复，与去除1 h 时G2/M 期细胞比例（34.84%）相比，去除3 h后G2/M 期细胞比例（24.9%）显著降低，差异有统计学意义（χ²=11.590，P=0.001）；细胞凋亡比例差异也有统计学意义（χ²=3.879，P=0.049）。详见图2。

图2 去除药物作用后在1 h、2 h、3 h、4 h、5 h 等不同时间对BIU-87 细胞周期和凋亡的影响

2.3 STLC 对细胞的生长增殖抑制作用、凋亡及Eg5 mRNA 和蛋白表达的影响

从下表1 可见，与对照组相比，STLC 处理组细胞增殖抑制率和凋亡指数均显著升高，差异有统计学意义（P＜0.001）；与对照组相比，STLC 处理组Eg5 mRNA和蛋白的表达水平均显著降低，差异有统计学意义（P＜0.001）。以上结果表明，STLC 可明显抑制BIU-87 细胞生长及诱导其凋亡，并显著降低Eg5 mRNA 和蛋白的表达水平。

表1 两组BIU-87 细胞生长抑制率、凋亡指数及Eg5 相对表达水平的对比（± s ）

表1 两组BIU-87 细胞生长抑制率、凋亡指数及Eg5 相对表达水平的对比（± s ）

组别 细胞增殖抑制率 凋亡指数 Eg5 mRNA 相对表达 Eg5 蛋白相对表达空白对照组 1.92±0.17 3.94±0.46 1.32±0.21 1.07±0.09 STLC 处理组 16.58±4.23 19.25±4.46 0.57±0.05 0.46±0.07 t 值 77.433 76.353 77.688 119.631 P 值 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001

3 讨论

肿瘤的发生、发展是各复杂病因学机制和多基因组参与、多阶段形成的动态过程，包括肿瘤细胞的增殖、黏附、血管形成和侵袭、转移等复杂环节。在此过程中，肿瘤细胞生长因子信号通路的持续激活状态，能使肿瘤细胞具有无限增殖的能力，进而导致细胞增殖不受机体调控及形成大量非整倍体细胞，因此抑制肿瘤细胞增殖成为肿瘤治疗的基本策略之一。我们在前期研究中发现人膀胱尿路上皮癌肿瘤干细胞的增殖性较强，同时其自我更新能力也较强[9]。近年来，随着对肿瘤干细胞研究的不断深入，人们逐渐认识到肿瘤细胞具有异质性，并非所有肿瘤细胞的生物学行为都相同，只有少部分肿瘤细胞具有广泛增殖、能形成肿瘤或引起肿瘤转移的能力。在肿瘤发生和发展的过程中，细胞有丝分裂中的纺锤体在细胞增殖中起着重要作用[10-11]。驱动蛋白Eg5 位于人染色体10q24.1，在有丝分裂前中期推动双极纺锤体分离的过程中起关键作用，其过度表达会导致纺锤体缺失、遗传不稳定、细胞分裂异常和基因组不稳定，从而导致肿瘤的发生[12]。Castillo 等[13]在利用基因敲除技术研究转基小鼠的过程中发现，Eg5 表达较高会干扰纺锤体组装并造成其功能紊乱，引起双极纺锤体的分离缺失及基因组的不稳定性增加，导致肿瘤发生。驱动蛋白Eg5 参与了细胞有丝分裂的关键环节，人体成熟组织细胞中存在微量Eg5 的表达，但很多恶性肿瘤组织中Eg5 均存在异常过度表达，目前Eg5 已成为肿瘤发生发展的关键基因和重要的治疗靶点。研究还发现，高表达Eg5 的乳腺癌患者往往预后不良，其机制在于内源性Eg5 通过激活Wnt/β-catenin 信号通路从而增强了乳腺癌干细胞的生物学功能和自我更新能力[14]。卢正磊等[15]研究也发现伴有门脉癌栓的肝癌组织Eg5 的表达率高达75%，特别是在较高的TNM 分期、病理分级和伴有门脉转移时Eg5的表达率会更高；而Eg5 mRNA 的表达则与肝癌患者的性别差异、年龄大小、肿瘤包膜完整与否等均无显著相关性。以上研究均表明Eg5 作为一个肿瘤侵袭、进展的重要独立预测标志物，既可作为膀胱肿瘤的预后标志物，也可作为药物治疗的靶点和疗效评估指标。通过抑制Eg5的表达能够引起细胞周期的停滞，最终可导致细胞凋亡，但不会对微管参与的其他生物过程造成破坏。这与传统作用于微管的药物不同，不会影响微管的稳定性，也不会产生神经毒性，因此，现阶段驱动蛋白Eg5 已成为肿瘤化疗药物新的作用靶点，备受药学界的关注。2004 年STLC 被学者测量出分子式为C22H21NO2S，分子量为363.5，且结构简单、易合成、价格低廉。随后DeBonis等[7]通过微管激活三磷酸腺苷（ATP）酶活性抑制实验首次证明STLC 能特异地结合肿瘤细胞高表达的Eg5 蛋白分子，诱导Eg5 产生变构效应而丧失功能，导致纺锤体极向运动受阻、双极纺锤体不能正确形成，从而出现大量单星状纺锤体细胞，阻滞细胞的有丝分裂进程并引起细胞凋亡，是Eg5 蛋白有效的靶向抑制剂，具有高度的特异性、有效性和安全性，且高浓度的STLC 对处于分裂间期的细胞没有毒副作用，显示出较强的抗肿瘤活性，极有临床开发和应用价值。此外，还有研究发现STLC 能阻断Ph 染色体阳性的白血病细胞G2/M 的细胞周期进程，并导致白血病细胞凋亡，提示STLC 在恶性血液病中具有重要的潜在治疗价值[16]。本研究通过体外实验发现STLC 可抑制膀胱尿路上皮癌BIU-87 细胞的增殖，并能阻滞BIU-87 细胞的有丝分裂进程及诱导细胞凋亡、抑制细胞增殖，且这种细胞程序性凋亡的发生与药物作用时间呈密切正相关，这可能是STLC 治疗膀胱癌的具体机制。此外，在本研究中，我们根据RT-PCR和Western Blotting 实验结果发现，STLC 能显著抑制膀胱尿路上皮癌BIU-87 细胞中Eg5 的表达。根据以上研究结果，我们猜测STLC 可能通过抑制BIU-87 细胞中Eg5的表达，进而进一步阻滞细胞有丝分裂周期进程、抑制细胞增殖和诱导细胞凋亡的发生。以上研究结果再次验证了STLC 在抑制膀胱癌细胞的生长和发展过程中起到的重要作用，同时也为STLC 在膀胱肿瘤的治疗中提供了新的实验数据和初步理论基础。Kozielski 等[17]研究显示，STLC 处理HeLa 细胞24 h 后可见Caspase9 表达水平随药物剂量的增加而升高，Caspase8 的升高则发生在给药后48 h ；而凋亡效应分子Caspases3 和PARP1 仅见微弱升高，表明STLC 通过激活纺锤体组装检查点蛋白BubR1、细胞周期素B 以及促进极光激酶A 表达增高而致细胞凋亡，提示STLC 可通过传统的线粒体途径介导细胞凋亡，同时还可能通过Caspase 非依赖途径介导细胞凋亡。

通过对本研究内容的总结和思考，有必要对STLC下调膀胱肿瘤Eg5 表达和抑癌的分子机制进行下一步的探索，这将有助于我们阐明膀胱癌有关细胞有丝分裂过程的发生机制，对临床肿瘤预后的判断、抗肿瘤靶点的选择及研发相关的靶向药物提供新的依据和理论基础，而这都需要在以后更多的研究中得到印证。此外，STLC在不同人膀胱癌中的作用是否存在差异还需要进一步研究证实。