不同制备方法测定银黄滴丸中绿原酸含量的分析

孙振平，于德龙，于 毓，仲 娜

（1. 青岛市食品药品检验研究院，山东 青岛 266071 ；2. 青岛市城阳区人民医院，山东 青岛 266108）

银黄滴丸是一种中成药配方制剂，含有金银花及黄芩的提取物等成分，临床常用于治疗上呼吸道感染、急慢性咽喉炎、肺热咳嗽、目赤肿痛等病症[1-3]。绿原酸（Chlorogenic Acid，CA）是金银花提取物的主要成分，具有抗病原微生物、解热、调脂、抗炎、增强机体免疫力等作用[4-5]。CA 分子结构中有酯键、多元酚等不稳定部分，衰减较快，在水中极易水解，且对光、热稳定性均较差，常温条件下保存，随着时间的延长CA 含量会不断下降[6-7]。在样品提取过程中，往往因水解和分子内酯基迁移发生异构化等多种因素而导致有效成分的提取率明显下降。本文通过相关试验，建立供试品溶液最优制备方法，用以测定银黄滴丸中CA 含量。

1 仪器与材料

LC-10Atvp 岛津高效液相色谱仪；N2000 色谱工作站（浙江大学智达信息工程研究所）；TU1800S 型紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司）；KQ3200 型超声波清洗仪（昆山市超声仪器有限公司）；Milli Q 超纯水机（法国Millipore 公司）；CA 对照品（中国药品生物制品检定所，批号：110753 - 200212，供含量测定用）；银黄滴丸（自制）；乙腈（色谱纯）；水为超纯水；其余试剂均为分析纯。

2 方法和结果

2.1 线性关系考察

2.1.1 色谱条件 色谱柱：Kromasil C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：乙腈-0.4% 磷酸溶液（13:87），流速：1.0 mL/min ；检测波长：327 nm；柱温：30℃。理论板数为CA 峰计算不低于3000[8-9]。

2.1.2 线性关系考察 精密称取CA 对照品2.2 mg，置50 mL 棕色量瓶中，加50% 甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，作为母液。精密量取母液1 mL、2 mL、4 mL、6 mL、8 mL、10 mL 至10 mL 棕色量瓶中，加50%甲醇至刻度，摇 匀， 即 得 浓 度 为4.4 μg/mL、8.8 μg/mL、17.6 μg/mL、26.4 μg/mL、35.2 μg/mL、44 μg/mL 的对照品溶液（10℃以下保存）。分别精密吸取上述对照品溶液各20 μL 进样，记录色谱图（见图1），测定峰面积并进行线性回归（Y 表示峰面积，X 表示浓度），得回归方程：Y=47128.82X-4952.86，r=0.99999 ；结果表明CA 在0.088 ～0.88 μg 范围内有良好的线性关系。

图1 对照品色谱图

2.2 精密度试验

精密吸取上述对照品溶液各20 μL，重复进样6 次，以峰面积计算相对标准偏差（RSD），结果显示RSD=0.22%。RSD 小于2%，表明仪器的精密度良好。

2.3 供试品溶液的制备

2.3.1 提取方法的选择 取本品，分别采用A. 超声波提取、B. 回流提取、C. 冷浸提取三种方法比较提取率，具体如下：A. 超声波提取：取重量差异项下的本品，研细，分别取0.5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50%甲醇，定容至25 mL，超声处理30 min，放至室温，滤过，精密量取续滤液1 mL，置10 mL 棕色量瓶中，加50% 甲醇至刻度，摇匀，滤过（0.45 μm 滤膜），滤液作为供试品溶液。B. 回流提取：按照超声波提取法操作，取样品0.5 g，加50% 甲醇，定容至25 mL，加热回流30 min，放至室温，其余同A。C. 冷浸提取：按照超声波提取法操作，取2 份样品各0.5 g，加50% 甲醇，定容至25 mL，冷浸提取30 min，放至室温，其余同A。按照上述色谱条件，分别测定上述三种提取液中CA 的含量，记录色谱图（见图2），结果见表1。结果表明，超声法提取率最高，主成分损失最小，故本文选择超声提取法。

图2 样品色谱图

表1 不同提取方法CA 含量的比较（mg/g）

2.3.2 提取溶剂的选择 分别取本品，研细，取2 份各0.5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，分别精密加入50%甲醇、50%乙醇、甲醇、乙醇四种不同溶剂，定容至25 mL，分别超声提取30 min，取出，放冷至室温，其余同超声波提取法。按上述色谱条件测定CA 含量，结果见表2。结果表明，甲醇、乙醇提取分离不好，50% 甲醇提取含量最高，故本文选择50%甲醇作为提取溶剂。

表2 提取溶剂考察结果（mg/g）

2.3.3 提取时间的选择 取本品，研细，取2 份各0.5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50% 甲醇，定容至25 mL，分别超声提取10 min、20 min、30 min、40 min、50 min，取出，放冷至室温，其余同超声波提取法。按上述色谱条件测定CA 含量，结果见表3。结果表明，超声提取30 min 后，CA 含量不再增加，故本研究选择超声提取30 min。

表3 不同提取时间CA 含量的比较

2.3.4 制备方法统计学分析 采用SPSS 17.0 软件对提取方法、提取溶剂、提取时间行ANOVA 分析，由表4 可见，提取方法、提取溶剂、提取时间组间影响差异不显著，经方差分析，由方差大小可见影响提取的顺序为B ＞A ＞C ；提取溶剂对提取效果影响最大，见表5。在CA 含量测定中，以50%甲醇超声提取30 min 为供试溶液的最佳制备方法。

表4 ANOVA 统计分析

表5 方差分析

2.4 稳定性试验

以经验证的制备方法制备供试品溶液，分别于0 h、4 h、8 h、12 h、16 h、20 h、24 h 分别进样20 μL，测得供试品中CA 峰面积分别为820586.875、828743.813、828833.063、821822.875、821823.500、826982.438、828647.250，平均峰面积为825348.545，RSD=0.46%，表明本法稳定性较好。

2.5 重复性试验

取6 份银黄滴丸样品（批号为20190601），分别为0.5036 g、0.4994 g、0.5100 g、0.5024 g、0.5203 g、0.5321 g，按供试品溶液制备方法制备并测定CA 含量分别为6.28 mg/g、6.28 mg/g、6.38 mg/g、6.22 mg/g、6.27 mg/g、6.27 mg/g，平均6.28 mg/g，计算RSD= 0.8%（n=6），表明本法重复性较好。

2.6 回收率试验

取已知含量的样品（批号：20040401）约0.25 g，精密称定，分别加入相当样品含量100% 的对照品，按照供试品制备方法操作，测定CA 含量，计算回收率，结果见表6。

表6 回收率实验结果

2.7 样品测定

取本品10 个批次的样品各0.5 g，分别按照上述制备方法制备供试品溶液并测定CA 含量，结果见表7。

表7 样品测定结果

3 讨论

CA 分子结构中有酯键、多元酚等不稳定结构，衰减较快，稳定性差，在水中极易水解，在甲醇、乙醇中相对稳定，且对光、热均不稳定。因此，样品的前处理可直接影响CA 含量测定的准确性。本文比较了三种提取方法、四种提取介质、五个提取时间对CA 含量测定的影响。经方差分析，提取介质对样品制备影响最大，影响顺序为提取溶剂、提取方法、提取时间。经比较发现，用甲醇提取分离效果差，乙醇提取率较低，以50% 甲醇超声提取30 min，样品提取率高，方法稳定性、重复性均良好，可很好地控制银黄滴丸中CA 的含量。