气相色谱-高分辨质谱联用法分析广藿香挥发油成分

陈欣陈巧兰吴泽吟李燕明

(1.珠检协科技(珠海)有限公司，广东 珠海 519015；2.珠海市食品药品检验所，广东 珠海 519015；3.拱北海关技术中心,广东 珠海 519015)

广藿香为唇形科植物广藿香(Pogostemon cablin Benth.)的地上部分，常用芳香化湿中药，有芳香化浊、开胃止呕、发表解暑功效，是著名成药“藿香正气丸(水)”的重要组成药物。广藿香的主要药物活性成分是其挥发油，据报道，广藿香挥发油对真菌、细菌有明显的抑菌作用[1,2]。

对于广藿香挥发油成分的分析，主要应用气相色谱、气相色谱-质谱联用仪进行定性分析[3-5]，通过与标准谱库对比确定化合物结构。然而，天然植物的挥发油的主要成分为萜类(主要为单萜及倍半萜类)、芳香类化合物，同类化合物质谱图非常相似，很难确定其结构，实际分析时与谱库中获得标准谱图时的条件无法完全一致，也给结构的确定增加了困难。

恒温保留指数是气相色谱定性分析中一个相对稳定的参数，自Kováts于1958年提出以来，得到了广泛的应用，并且有大量可参考的数据库、手册及文献[6]。但是由于天然植物挥发油成分的复杂性，一般都是在程序升温的条件下进行色谱分离分析，因此，在挥发油分析中，程序升温保留指数(PTRIs)较之恒温保留指数更具有实用价值。近期的一些研究也证明PTRIs是比较可靠的定性参数[7-9]。

利用GC-MS分析挥发油存在的另一个问题就是多种化合物在同一时间出峰，相互混淆，无法准确对成分进行鉴定。GC-MS分析还存在的一个问题就是一些浓度相对比较低的化合物，其相对极低的信噪比致使质谱很难检测到信号峰。

本研究旨在应用PTRIs和类分离方法(HPLC and Silica gel CC)分析广藿香挥发油，这些数据对于建立天然植物挥发油通用PTRIs数据库有很大贡献，并且为今后的挥发油分析前处理提供了新思路。

1 实验部分

1.1 仪器与材料

气相色谱Hewlett-Packard 6890(Agilent Technologies,USA)，气相色谱-高分辨质谱联用仪(Waters,UK)，MCP质谱检测器；石英毛细管柱HP-5(30m×0.25mm×0.25μm)。广藿香原材料为海南广藿香植物的干燥地上部分，经中国中医研究院中药研究所鉴定。正构烷烃(C6～C26)标样为色谱纯。

1.2 实验方法

1.2.1 广藿香挥发油的提取

按中国药典(2020年版)方法提取[10]，并计算其含油率为0.19%。

1.2.2 广藿香挥发油的类分离-硅胶柱分离方法

将0.2mL挥发油溶于1mL正己烷中，上样到硅胶柱(硅胶15g)层析分离，分别以石油醚、石油醚-乙醚(80∶20)、石油醚-乙醚(60∶40)、石油醚-乙醚(50∶50)、石油醚-乙醚(40∶60)、石油醚-乙醚(20∶80)、乙醚各100mL洗脱，30℃减压浓缩，TLC薄层色谱检测，得到7部分挥发油样品，待GC-MS检测。为避免偶然因素的影响，重新取0.2mL挥发油溶于1mL正己烷中，上样、洗脱与上述过程一致，得到另一组7部分挥发油样品待测。

1.2.3 广藿香挥发油的类分离-HPLC分离方法

50μL挥发油以正己烷稀释到50mL，取稀释后的样品20μL满环进样。分离使用的是正相柱ZORBAX CN(25×0.46cm.P.N.880952-705)(Agilent 1100 HPLC)，采用正己烷-异丙醇作为混合流动相，先以100%正己烷洗脱25min，至30min缓冲至95%正己烷(异丙醇5%)洗脱，然后以95%正己烷再洗脱至40min，流速为恒流1mL·min-1，通过气相色谱检测，合并相同部分，得到8部分挥发油样品，待GC-MS检测。为避免偶然因素的影响，重新取20μL挥发油进样，洗脱条件与上述过程一致，得到另一组8部分挥发油样品待测。

1.3 气相色谱-质谱联用分析参数

1.3.1 气相色谱分析条件

气化室温度260℃，程序升温：柱初温80℃，4℃·min-1升到260℃。氦气为载气，流速为1.0mL·min-1，分流比20∶1。

1.3.2 高分辨质谱仪分析条件

EI电离模式，电离电压70eV，离子室温度220℃，m/z40～400全扫描模式，质谱图2scans·s-1记录。

1.4 保留指数计算方法

应用由Van den Dool和Kratz[14]提出的公式(见下式)计算程序升温保留指数。

(1)

式中，IuT为程序升温保留指数；tn,tn+1和tu分别为碳数为n,n+1的正构烷烃标样及目标成分的气相保留时间。

2 结果与讨论

在应用气-质方法分析挥发油时存在2个问题，其一是重叠峰的存在。挥发油的成分一般十分复杂，一些化合物在气相色谱分析中在同一时间重叠出峰。本文采用HPLC及Silica gel CC(Silica gel Chromatography Column)2种分离方法对挥发油进行预处理。由于不同的极性特点，得以分离不同的部分。如，在原始未经处理的挥发油气-质总离子流图中，在20.93min只有一个宽峰(广藿香醇，匹配度52%)，但是经过HPLC方法分离后，得到的第5、6部分的离子流图显示其为2个峰的重叠(7(11)-Selinen-4à-ol,56%；Patchouli alcohol,89%)，其定性的可靠性大大提高。

另外,挥发油成分的含量参差不齐，有一些含量相对很低的化合物，在原始总离子流图中的信噪比相对极低，很难检测到。如，在1g挥发油样品中有1mg目标组分，为使高含量组分在质谱检测器中有很好的匹配，需将样品稀释到100mL，则该1mg的目标组分含量则为0.01mg·mL-1(10ppm)，很难检测到。而利用类分离方法后，高含量组分与低含量组分得以分离，含有目标组分的部分只需要稀释到10mL，所以能检测到更可靠的谱图信息。

如，图1b是原始未经类分离的挥发油总离子流图，在9.91min没有明显的谱峰，因为含量太低。图1a为经过硅胶柱前处理的部分，可见在9.91min处有一明显谱峰，经气-质定性为对丙烯基苯甲醚(匹配度79%)。同样的，在图1c(经HPLC预处理)中的18.19min(Cedr-8-en-13-ol,R.M.837)和18.46min(Flopropione,R.M.816)较图1d(未经处理样品)有更好的谱峰及匹配度。在图1c中19.24min(Calarene epoxide R.M.830)能够很清晰地被检测出来，但是在图1d中却未能检出。

图1 挥发油直接气-质分析及经过类分离离子流图对比

通过Silica gel CC分离辅助，识别出9个化合物。通过HPLC分离辅助，识别出10个化合物，另外有4个饱和烷烃通过2种方法共同辅助识别。所有鉴定出的化合物的PTRIs经计算并且列于表1中。其中带*标记的11种化合物在广藿香挥发油中未见报道。

表1 广藿香挥发油成分

续表 广藿香挥发油成分

3 结论

本文应用高效液相色谱(HPLC)及硅胶柱色谱(Silica gel CC)方法对广藿香挥发油进行类分离，并结合程序升温保留指数(PTRIs)辅助高分辨气质联用法(GC-TOF)，鉴定广藿香挥发油成分。鉴定出11种在广藿香挥发油中未见报道的化合物，并得出广藿香挥发油57种成分的程序升温保留指数。实验结果可用于建立天然植物挥发油通用PTRIs数据库，且补充了广藿香挥发油成分。