蘘荷不同提取物对慢传输型便秘小鼠作用比较

谷仿丽， 黄仁术， 何晓梅， 姜雪萍， 陈乃富， 韩邦兴， 邓 辉

(皖西学院生物与制药工程学院，安徽省中药资源保护与持续利用工程实验室，安徽 六安 237012)

慢性传输型便秘是功能性便秘中的一种类型，以结肠运行缓慢，水分吸收增加致大便干硬，排便次数减少，无便意并伴有腹胀腹痛的一种疾病[1]，临床上药物治疗远期效果不佳，停药后容易复发[2]。目前慢性传输型便秘发病机制尚不明确，近年来的研究认为其与肠道菌群失调及肠道水通道蛋白(aquaporin，AQPs)表达异常有关[3]。

蘘荷Zingibermioga(Thunb.) Rosc.又名阳荷、野姜、观音花等，具有祛痰止咳、解毒消肿、活血调经等功效，临床用于治疗咳嗽、腹痛腹胀、月经不调等病症。蘘荷含有蛋白质、脂肪、膳食纤维、微量元素及人体必需氨基酸等多种营养素及黄酮、多糖等成分[4]。前期进行蘘荷黄酮、多糖、色素的提取工艺及生物活性研究[5-9]，并进行蘘荷水提物对慢性传输型便秘小鼠肠运动的影响研究，发现蘘荷水提物可增加便秘小鼠首次排便时间、排便量，促进肠蠕动，但其作用机制及有效部位尚不明确。本实验基于肠道菌群及AQP3表达，初步筛选蘘荷治疗慢传输型便秘的有效部位。

1 材料

1.1 动物 昆明种小鼠，体质量18～22 g，购于安徽医科大学实验动物中心，动物生产许可证号SCXK(皖)2017-001。

1.2 试剂与药物 蘘荷，采于皖西大别山区，经黄仁术教授鉴定为蘘荷Zingibermioga(Thunb.)Rosc.。盐酸洛哌丁胺胶囊(西安杨森制药有限公司，批号191025433)；大黄通便颗粒(甘肃扶正药业科技股份有限公司，批号19052703)。RIPA裂解液(批号2002041)、磷酸化蛋白酶抑制剂(批号2007082)、5×蛋白还原型上样缓冲液(批号2003023)、HRP山羊抗兔抗体(批号2003304)(武汉赛维尔生物科技有限公司)；D3141粪便DNA试剂盒(广州美基生物科技有限公司，批号20092708)。

1.3 仪器 灰度分析软件(美国Alpha Innotech公司)；琼脂糖凝胶电泳仪(北京六一仪器厂)；凝胶成像系统(上海天能科技有限公司)；PCR 仪(苏州东胜兴业科学仪器有限公司)；Qubit 3.0荧光定量仪(美国Thermo Fischer公司)。

2 方法

2.1 蘘荷提取物的制备 取1 kg新鲜蘘荷，干燥，粉碎，过40目筛，继续干燥至恒重。取适量蘘荷粉末，以料液比1∶25、温度90 ℃提取2次，每次1.5 h，合并滤液，减压浓缩至提取物相对密度1.13，取出部分提取物，即得蘘荷水提物，继续浓缩至膏状，冷冻干燥；剩余蘘荷水提物缓慢加入4倍量95%乙醇，边加边搅拌至均匀，保鲜膜封口，4 ℃冰箱保存24 h，4 000 r/min离心10 min，取沉淀物冷冻干燥，即得蘘荷醇沉部位；醇溶部位减压浓缩至膏状，冷冻干燥，即得蘘荷醇溶部位；将干燥物粉碎，过100目筛，即得蘘荷水提物、醇沉部位、醇溶部位干粉。

2.2 蘘荷不同提取物对慢性传输型便秘小鼠排便的影响 选取健康小鼠60只，随机分为正常组、模型组、大黄通便颗粒组和蘘荷水提物、醇溶物、醇沉物组，每组10只。正常组及模型组灌胃0.5% CMC-Na溶液，给药组分别灌胃给予蘘荷水提物、醇溶物、醇沉物0.5 g/kg和大黄通便颗粒3 g/kg，连续14 d。末次给药前各组小鼠禁食不禁水16 h，末次给药后1 h，给药组及模型组灌胃盐酸洛哌丁胺4 mg/kg复制便秘模型，正常组灌胃等容量蒸馏水，30 min后，每只小鼠灌胃5%活性炭溶液0.1 mL。记录每只小鼠首次排出黑便时间以及8 h内排出黑便的总粒数及总重量。

2.3 蘘荷不同提取物对慢性传输型便秘小鼠小肠推进率及AQP3表达的影响 选取健康小鼠60只，按“2.2”项下方法进行分组、给药及造模，15 min后脱颈椎处死，取小肠，测量小肠全长及碳末推进距离，计算各组小肠推进率。取升结肠并剖开，用预冷的磷酸缓冲盐溶液洗涤以去除血污，剪成小块置于匀浆管中进行匀浆；取出匀浆液，4 ℃、12 000 r/min离心10 min，取上清，即为总蛋白溶液，Western blot法检测结肠AQP3表达[10]。

2.4 蘘荷不同提取物对慢性传输型便秘小鼠肠道菌群的影响 选取健康小鼠60只，按“2.2”项下方法进行分组、给药及造模，30 min后，取小鼠粪便，立即液氮保存备用。取小鼠粪便解冻，根据试剂盒说明书，提取粪便DNA，NanoDrop微量分光光度计检测DNA浓度，琼脂糖凝胶电泳检验核酸样本的完整性。以稀释后的DNA为模板，选用细菌16S rRNA (V3-V4)区域引物，进行 PCR 纯化和扩增，341 bp正向序列5′-CCTACGGGNGGCWGCAG-3′，806 bp反向序列5′-GGACTACHVGGGTATCTAAT-3′。使用AMPure XP Beads对第2轮扩增产物进行纯化，用ABI StepOnePlus Real Time PCR 系统进行定量，根据Novaseq 6000的PE250模式pooling上机测序。

3 结果

3.1 蘘荷不同提取物对慢性传输型便秘小鼠排便的影响 与正常组比较，模型组小鼠首次排便时间延长(P<0.01)，排便粒数及重量减少(P<0.01)；与模型组比较，蘘荷各提取物组首次排便时间均缩短(P<0.01)，排便粒数及重量均增加(P<0.05，P<0.01)，表明相同剂量的蘘荷不同提取物均有促进便秘小鼠胃肠运动的作用，以水提物作用最佳。结果见表1。

表1 蘘荷不同提取物对慢性传输型便秘小鼠排便的影响

3.2 蘘荷不同提取物对慢性传输型便秘小鼠小肠推进率的影响 与正常组比较，模型组小鼠小肠推进率降低(P<0.01)；与模型组比较，蘘荷各提取物组小肠推进率升高(P<0.05，P<0.01)，表明蘘荷各提取物均具有推动便秘小鼠小肠运动的作用，各提取物组间比较无统计学差异(P>0.05)。结果见图1。

3.3 蘘荷不同提取物对慢性传输型便秘小鼠结肠AQP3表达的影响 与正常组比较，模型组小鼠AQP3表达提高(P<0.05)，表明模型小鼠结肠水分吸收增加；与模型组比较，蘘荷水提物、醇沉物组和大黄通便颗粒组AQP3表达均降低(P<0.05)，表明蘘荷水提物、醇沉物均有降低模型小鼠升结肠水分吸收，改善大便干燥症状。结果见图2。

3.4 蘘荷不同提取物对慢性传输型便秘小鼠肠道菌群的影响

3.4.1 对肠道菌群物种组成的影响 各组均选取在门、纲、目、科、属、种水平上OTU排名前10的物种进行比较，绘制以门水平的物种为例的相对丰度堆积柱形图(图3)。在门水平上，各组均以拟杆菌门、厚壁菌门、变形菌门为优势菌群，各组所占比例不同，模型组小鼠变形菌门>厚壁菌门>拟杆菌门，蘘荷水提物小鼠拟杆菌门>厚壁菌门>变形菌门，蘘荷醇溶物组小鼠厚壁菌门>拟杆菌门>变形菌门，醇沉物组变形菌门>拟杆菌门>厚壁菌门。与模型组比较，蘘荷水提物、醇溶物组小鼠拟杆菌门、厚壁菌门的相对丰度升高，变形菌门降低；蘘荷醇沉物组变形菌门、拟杆菌门的相对丰度升高，厚壁菌门降低。

3.4.2 对慢性传输型便秘小鼠肠道菌群α多样性指数的影响 α多样性指数是评价单个体内微生物群落丰富度和多样性的统计学分析指标，Sobs、Chao 1 指数是评价小鼠肠道菌群的物种丰富度指标，数值越大丰富度越高；Shannon、Simpson指数评价物种多样性指标，数值越大多样性越高[11]。由表2可知，与正常组比较，模型组Sobs、Chao 1、Shannon、Simpson指数均降低(P<0.05，P<0.01)，表明模型组小鼠菌群丰富度及多样性均降低；与模型组比较，蘘荷水提物组、大黄通便颗粒组各指数均升高(P<0.05，P<0.01)，蘘荷醇溶物组Chao 1、Simpson指数升高(P<0.05)；与蘘荷水提物组比较，醇沉物组各指数均降低(P<0.05)，醇溶物组Sobs、Shannon指数降低(P<0.05)。表明蘘荷水提物、醇溶物能调节便秘小鼠肠道菌群的丰富度及多样性，以水提物调节作用最佳，醇沉物无调节作用。

3.4.3 对慢性传输型便秘小鼠肠道菌群β多样性的影响 非度量多维尺度法统计(non-metric multidimensional scaling，NMDS)主要通过样本点与点之间的距离评价样本间微生物群落组成的相似性，即样本点距离越近则物种组成越相似，越远则物种组成差异越大[12]；以stress值评估模型的可靠性，值越小评估样本间的差异性就越准确，一般stress值小于0.1表示模型较可靠。各组样本间均具有一定的距离，其中蘘荷水提物组与正常组、大黄通便颗粒组距离较近，与模型组和蘘荷醇溶物、醇沉物组距离较远；与蘘荷醇沉物组比较，蘘荷醇溶物组样本距离模型组距离较远。由图4可知，stress小于0.1，表明NMDS法能准确评价蘘荷各提取物对慢性传输型便秘小鼠肠道菌群引起的差异性，提示各组间肠道菌群物种组成存在差异。

表2 蘘荷不同提取物对慢性传输型便秘小鼠肠道菌群α多样性指数的影响

4 讨论

人体结肠有AQP1～AQP4、AQP8～AQP9表达，分别参与结肠水分吸收与分泌，其表达异常可引起如便秘、腹泻等肠道疾病[13-15]。慢性传输型便秘患者切除的结肠中AQP3表达增加，表明AQP3在该病发生发展中起到重要作用[16]。在多种因素影响下，肠道菌群失调，导致肠蠕动减慢，水分吸收增加，引发慢性传输型便秘，故改善肠道菌群失调已成为治疗该病的新靶点[17]。

目前治疗慢性传输型便秘常用药物有促动力药、刺激性及渗透性泻药等，临床疗效欠佳，且副作用明显[17]。膳食纤维被推荐用于慢性便秘的基础治疗[18]，增加膳食纤维摄入可降低便秘发病率[19]，但也有研究得出相反观点[20]。中药多组分、多途径、多靶点治疗疾病且副作用小的特点决定其临床治疗的优势[21]，研究发现大黄、霍山石斛、增液汤等可通过调节肠道AQP表达及肠道菌群缓解便秘小鼠症状[22-23]；复方益气养阴通便汤、黄芪润肠丸能有效提高便秘患者有益菌比例，改善患者症状，且远期疗效明显[24-25]，表明中药可通过调节肠道菌群、改善结肠AQP表达治疗便秘。

蘘荷中粗纤维含量达28%[4]，是其促消化的物质基础。蘘荷水提物能促进肠蠕动，从而促排便，改善便秘小鼠症状。植物中膳食纤维分为水溶性和水不溶性(醇溶)膳食纤维[26]，因此，将蘘荷水提物溶液中加入乙醇，将其分离为醇沉物和醇溶物，与水提物比较对慢性传输型便秘小鼠的作用，以筛选最佳有效部位。结果发现，蘘荷水提物可促进慢性传输型便秘小鼠排便，降低AQP3表达，提高肠道有益菌的比例及菌群丰富度、多样性，且作用优于醇溶物、醇沉物组；蘘荷醇溶物组促排便、调节肠道菌群的作用优于醇沉物；蘘荷醇沉物组降低AQP3表达的作用优于醇溶物组。

药效物质基础研究是中药研究的根本问题[27]，随着中药化学分离及活性追踪技术的发展，从中药中获得有效部位或单体物质用于药效学研究成为可能，但只能分离出少数活性较强的成分，大部分中药成分纯度越高疗效越差，甚至无效，而单味中药或与其他中药组成复方多组分，协同发挥了较好的药理效应，体现了中药治疗的整体观[28]。综上所述，蘘荷水提物是抗慢性传输型便秘小鼠最有效的部位。