三七及其2个近缘种的分子鉴定

黄玉玲， 李 玲， 杨玉玲， 杨清松， 彭翠仙， 田迎秋

(1.文山州农业科学院，云南 文山 663099；2.文山学院三七医药学院，云南 文山 663099)

三七Panaxnotoginseng(Burk.) F.H.Chen是五加科人参属的药用植物，但由于鉴别和认识能力不足，民间将分布区存在重叠的姜状三七Panaxzingiberensis、屏边三七Panaxstipuleanatus等此类三七近缘种统称为野三七。为合理有效利用三七及其近缘种资源，有必要对其进行准确分类及鉴定。

DNA条形码(DNA barcoding)分子鉴定技术是由动物学家Paul Hebert[1]于2003年提出的，是利用基因组中一段标准的、相对较短的、具有足够变异的、易扩增的DNA序列来进行物种鉴定的一种分子生物学技术。Hollingsworth等[2]建议将质体片段matK、rbcL、psbA-trnH作为植物的通用条形码，并推荐将matK和rbcL联合使用。错用和混用药材威胁用药安全，分子鉴定技术能从分子水平提供鉴别依据以减少错用和混用现象，已成为目前药材鉴定的热点，如蒋超等[3]采用多重位点特异性PCR鉴别人参、三七、西洋参的掺杂问题，魏妙洁等[4]采用ITS2序列准确鉴定出市售三七片的原料药材，基于ITS2序列可准确鉴别出藏柴胡及其易混品[5]、人参与西洋参[6]、九里香药材及其近缘物种[7]、东北透骨草及其混伪品[8]，基于ITS序列可准确鉴定北柴胡种子及其混伪品[9]，采用ITS2及psbA-trnH可准确鉴别出鸡血藤及其混伪品[10]、白头翁及混伪品[11]、含岩白菜素药用植物[12]。虽然DNA条形码技术在人参属物种鉴定中已有应用[13]，但由于相近类群单位点的DNA条形码缺乏足够的变化，所以不能鉴别所有种。与通用DNA条形码相比，rDNA明显提高了物种鉴定能力[14]，因此，为区分三七及其文山地区常见的易混淆种姜状三七和屏边三七，本研究综合使用质体片段及核片段，对ITS、matK、psbA-trnH序列进行扩增、测序及分析，探讨这三个片段用于三者鉴别的可行性，以期建立快速准确的分子鉴定方法。

1 材料

三七Panaxnotoginseng(Burk.) F.H.Chen、屏边三七Panaxstipuleanatus、姜状三七Panaxzingiberensis共17批，采自云南文山、马关、金平等地，经中国科学院昆明植物研究所纪运恒博士鉴定为正品，具体信息见表1。

2 方法

2.1 DNA提取 采用改良型CTAB法。

2.2 PCR扩增和测序 采用人参属DNA条形码候选序列[15]中信息位点数较多、片段长度较短的ITS、matK、psbA-trnH进行分析，引物信息见表2。PCR扩增反应条件为总体积25 μL，其中dNTP 1 μL(10 mmol/L)、Taq Buffer(with MgCl2)2.5 μL(10X)、引物各1 μL(10 μmol/L)、Taq酶0.2 μL(5 U/μL)、模板DNA 1～2 μL(20～50 ng/μL)；扩增程序为预变性95 ℃ 5 min(变性94 ℃ 30 s，退火58～59 ℃ 30 s，延伸72 ℃ 60 s)×38个循环，修复延伸72 ℃ 10 min。测序工作由上海生工生物工程股份有限公司完成，引物为PCR扩增中的正向、反向引物(双向测序)。

表1 样品信息

表2 引物信息

2.3 序列处理与数据分析 应用Geneious Prime软件对17批样品的测序结果进行拼接和比对，去除低质量序列及引物区，再通过MEGAX64统计已比对序列的长度、变异位点及信息位点数量，并计算其K2P遗传距离。为确定物种鉴定成功率，即检验同一物种的不同个体能否聚类到一起，采用MEGAX64建立NJ树，通过Kimura两参数模型(Kimura 2-parameter model)重复1 000次的靴带分析法(Bootstrap method)进行，Gaps和Missing data采用配对状态删除(pairwise deletion)。NJ树上每个物种形成单系、支持率不低于50%的物种则认为鉴定成功，并且统计各候选片段的的扩增成功率、测序成功率、物种鉴定成功率。

3 结果

3.1 PCR扩增与测序 见表3。

表3 3个DNA条形码特征比较

3.2 序列变异 如表3所示，ITS的比对长度为611 bp，变异位点、信息位点数分别为45、40，所占比例分别为7.36%、6.55%，在3个片段中变异最大；psbA-trnH的比对长度为508 bp，在3个片段中长度最短，变异位点、信息位点数均为16，所占比例为3.15%；matK比对长度为799 bp，变异位点、信息位点数分别为18、16，所占比例分别为2.25%、2.00%，是3个片段中变异最小的。

在种内种间平均遗传距离上，4个片段的种间分歧均大于种内分歧，均满足条形码标准。其中，ITS的种间平均变异(0.044 105)、种内平均变异(0.001 371)大于另外2个片段，psbA-trnH次之(0.017 859、0.000 931)，matK最小(0.013 631、0.000 278)。综上所述，ITS、psbA-trnH、matK序列种内种间平均遗传距离差异较大，均适合作为三七及其两个近缘种鉴别的DNA条形码。

PCR成功率变化范围在94.12%～100.00%之间，测序成功率变化范围在93.75%～94.12%之间。3个片段中psbA-trnH、matK的PCR成功率达100%，单次测序成功率均为94.12%；ITS的PCR成功率和测序成功率较psbA-trnH、matK稍低，分别为94.12%、93.75%。

3.3 NJ系统发育树 ITS片段在人参属6个种中的物种鉴定成功率为100%。除人参(Panaxginseng)、西洋参(Panaxquinquefolius)外，三七(Panaxnotoginseng)、屏边三七(Panaxstipuleanatus)、姜状三七(Panaxzingiberensis)、疙瘩七(Panaxjaponicasvar.bipinnatifidus)支持率均大于90%，即得到成功鉴定，见图1。

psbA-trnH片段在人参属6个种的物种鉴定中，仅姜状三七(Panaxzingiberensis)、三七(Panaxnotoginseng)支持率大于90%，屏边三七(Panaxstipuleanatus)也得到准确鉴定，支持率为79%，见图2。

matK片段在屏边三七(Panaxstipuleanatus)、假人参(Panaxpseudo-ginseng)、三七(Panaxnotoginseng)的鉴定中，支持率均大于80%，均得到成功鉴定，见图3。

4 讨论

由于三七(Panaxnotoginseng)、姜状三七(Panaxzingiberensis)、屏边三七(Panaxstipuleanatus)在形态特征上相似且化学成分存在差异，为保证三七用药的安全性，有必要对三者进行准确鉴别，由于传统鉴定方法多是基于形态学特征，依赖长期经验的积累，物种鉴定困难。本研究通过分析三七及其近缘种的3个DNA条形码的特征，计算物种的种内、种间遗传距离，评估序列的barcoding gaps，使用邻接法(Neighbor-Joining, NJ)构建系统树等方法来评估3个DNA条形码在三七及其两个近缘种鉴定中的适用性。实验结果表明，综合引物通用性、序列变异、信息位点、种内种间平均遗传距离、扩增成功率及测序成功率、物种鉴定成功率等方面，可知ITS片段和psbA-trnH片段可用于三七(Panaxnotoginseng)、姜状三七(Panaxzingiberensis)及屏边三七(Panaxstipuleanatus)的分子鉴定中，matK可用于鉴别三七(Panaxnotoginseng)和屏边三七(Panaxstipuleanatus)。虽psbA-trnH的物种鉴定率稍低(50%)，但这可能是由于疙瘩七(Panaxjaponicasvar.bipinnatifidus)、人参(Panaxginseng)、西洋参(Panaxquinquefolius)的个体数过少(1～2个个体)导致的，加大取样量可能有助于解决鉴定率低的问题，未来可通过加大取样量来提高鉴定的准确性。

综上所述，ITS在3个片段中的序列变异最大(有45个变异位点和40个信息位点)，物种鉴定率最高(100%)，可作为三七(Panaxnotoginseng)、姜状三七(Panaxzingiberensis)、屏边三七(Panaxstipuleanatus)的快速鉴定条形码；psbA-trnH虽物种鉴定率稍低(50%)，但三七(Panaxnotoginseng)、姜状三七(Panaxzingiberensis)、屏边三七(Panaxstipuleanatus)均得到了准确鉴定；matK能准确鉴别出三七(Panaxnotoginseng)及其屏边三七(Panaxstipuleanatus)，可用于三七及其屏边三七的物种鉴定。三七具有较高的药用价值和经济价值，分子鉴定的开展有助于解决产品掺假等问题，进而维持市场稳定、保护消费者权益。