四君子汤含药血清对IEC-6细胞增殖及RhoA、p21、Cdk2表达的影响

涂小华， 杨光勇， 杨 欣， 邓 颖， 徐萌萌， 魏砚君， 万 亿， 王 慧

(贵州中医药大学基础医学院，贵州 贵阳 550025)

胃肠黏膜对机体有特殊的保护作用，非甾体类抗炎药物、酒精、微生物感染等均可引起其损伤。黏膜损伤后，机体将启动快速修复机制，包括上皮细胞迁移、细胞增殖、细胞凋亡、黏膜重构等环节，而多胺可通过调控钾通道蛋白及钙离子信号等促进上皮细胞迁移过程[1-2]，调控生长相关基因蛋白而促进正常上皮细胞增殖及黏膜生长过程，还可影响上皮细胞凋亡等环节[3]。Rho GTP酶(RhoA)既是细胞骨架重建的重要调控因子，又可调控细胞增殖过程[4-6]；p21是细胞周期蛋白依赖性激酶的抑制因子之一，对细胞增殖有重要负调控作用；细胞周期蛋白依赖性激酶2(cyclin-dependent kinase 2，Cdk2)通过调控细胞周期进程而影响上皮细胞增殖及细胞凋亡等环节[6-7]。另外，多胺可通过调控上述基因蛋白表达而促进小肠上皮细胞增殖[6,8]。

四君子汤源于《太平惠民和剂局方》，具有益气健脾之功效，常用于治疗慢性胃炎、胃及十二指肠溃疡等属脾虚者。有研究表明，四君子汤可修复胃肠黏膜损伤，其机制与影响多胺信号通路有关[9-12]。上皮细胞增殖是黏膜损伤后修复的重要环节之一，但四君子汤促进上皮细胞增殖的具体作用机制尚未明确，故本研究探索了该方对IEC-6细胞增殖，多胺调控RhoA、磷酸化Cdk2蛋白表达，p21、Cdk2 mRNA和蛋白表达的影响，以期为相关研究提供参考。

1 材料

1.1 细胞 大鼠小肠上皮细胞IEC-6，购自上海中乔新舟生物科技有限公司，货号ZQ0783。

1.2 动物 健康SD大鼠20只，雌雄各半，体质量180～220 g，购自长沙市天勤生物技术有限公司，实验动物生产许可证号SCXK(湘)2019-0014，实验动物合格证号11072622011001638，适应性喂养1周后制备含药血清。

1.3 试剂与药物 人参、茯苓、炒白术、炙甘草,购自北京同仁堂股份有限公司(贵阳分店)，经专家鉴定为正品。胎牛血清(批号1606F，澳大利亚Bovogen Biological公司)；青霉素-链霉素双抗(批号20200211)、高糖DMEM(批号20200720)、胰酶(批号20191030)，购自赛澳美细胞技术(北京)有限公司；腐胺(货号D13208-25G)，购自美国Sigma公司；α-二氟甲基鸟氨酸(DFMO，批号3305986)，购自德国Calbiochem公司；MTT(批号1015D058)、BCA蛋白浓度测定试剂盒(货号PC0020)，购自北京索莱宝科技有限公司；RIPA裂解液(货号P0013B)、PMSF(货号ST506)、SDS-PAGE凝胶试剂盒(货号P0012A)、5×蛋白上样缓冲液(货号P0285)，购自上海碧云天生物技术有限公司；磷酸蛋白酶抑制剂(批号K10151133EE8D)，购自美国APExBIO公司；ECL化学发光液(货号1705060)，购自美国Bio-Rad公司；β-actin一抗(货号4970S)、GAPDH一抗(货号5174S)、RhoA一抗(货号2117S)、Cdk2一抗(货号18048S)、Phospho-Cdk2 (Thr160)一抗(货号2516S)，购自美国CST公司；p21一抗(货号ab109199)、山羊抗兔IgG抗体(批号GR3321256-7)，购自英国Abcam公司；RNA提取试剂盒(货号9767)、逆转录试剂盒(批号AJ92011A)、PCR荧光染料(批号AJE1687A)，购自宝日医生物技术(北京)有限公司。

1.4 仪器 RE-5203旋转蒸发器(上海亚荣生化仪器厂)；3111 CO2培养箱、Multiskan go酶标仪、Nanodrop lite超微量紫外可见光分光光度计、Multifuge X1R离心机(美国Thermo Scientific公司)；DMil倒置相差显微镜(德国徕卡公司)；TC-96/G/H(b)梯度PCR仪(杭州博日科技股份有限公司)；CFX96荧光定量PCR仪、Power PacTMBasic电泳仪、ChemicDocTMXRS+成像(美国 Bio-Rad公司)。

2 方法

2.1 空白、含药血清制备 取人参、茯苓、炙甘草、炒白术各75 g，剪碎，12倍量水浸泡2 h后煎煮提取2 h，收集滤液，同法再煎煮1次，合并2次滤液，减压浓缩至生药量为1 g/mL的水提液。将大鼠随机分为四君子汤组、空白组，每组10只，四君子汤组灌胃相应水提液，给药剂量为每天13 g/kg(相当于人临床给药剂量约20倍)，而空白组灌胃等体积生理盐水，每天2次，连续4 d，第4天一次性灌胃全天剂量。给药2 h后乙醚麻醉大鼠，腹主动脉采血，血样静置2 h后3 000 r/min离心15 min，分离血清，混匀同组血清，在56 ℃下灭活30 min，0.22 μm微孔滤膜过滤后分装，置于-20 ℃低温冰箱中保存备用。临用前，以含0.5%胎牛血清的DMEM将空白血清稀释成10%培养基，四君子汤血清稀释成5%、10%、20%培养基。

2.2 IEC-6细胞培养及MTT法检测细胞增殖 参照文献[9]报道的方法，IEC-6细胞以5×104/mL密度接种于96孔板，每孔200 μL，以含5%胎牛血清的DMEM培养24 h，弃培养基，参照文献[13-14]报道加入不含血清的DMEM进行血清饥饿24 h后，对照组每孔加入含10%空白血清培养基，阳性对照组加入含腐胺(终浓度10 μmol/L)的10%空白血清培养基，含药血清低、中、高剂量组分别加入5%、10%、20%四君子汤含药血清培养基，总体积为200 μL。在DFMO负荷实验中，除对照组外其余各组均加入2.5 mmol/L DFMO，DFMO组加入含DFMO(终浓度2.5 mmol/L)的10%空白血清培养基，培养24、48、72 h后，每孔加入20 μL MTT(5 mg/mL)，在37 ℃下避光孵育4 h后弃培养液，每孔加入150 μL DMSO，室温振荡10 min，酶标仪于490 nm波长处检测吸光度，以吸光度表示细胞增殖活力。每组5个复孔，实验重复3次。

2.3 RT-qPCR法检测p21、Cdk2 mRNA表达 IEC-6细胞以8×104/mL密度接种于6孔板，每孔2.5 mL，血清饥饿及给药方法同“2.2”项(培养基体积为2.5 mL)。培养48 h后，RNA提取试剂盒提取各组细胞总RNA，检测其纯度及浓度，逆转录试剂盒将各组样品逆转录为cDNA，反应条件为37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s，所得cDNA样品加入引物及荧光染料，在荧光定量PCR仪上进行PCR反应，反应条件为25 μL总体系，95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，共 40个循环。以β-actin为内参，采用2-ΔΔCT法计算p21、Cdk2 mRNA相对表达，每组3个复孔，重复3次，引物合成由生工生物工程(上海)股份有限公司完成，序列见表1。

2.4 Western blot法检测RhoA、p21、Cdk2及p-Cdk2蛋白表达 IEC-6细胞以8×104/mL密度接种于6孔板，每孔2.5 mL，血清饥饿及给药方法同“2.2”项(培养基体积为2.5 mL)。给药培养48 h后刮取细胞，并用RIPA裂解液(临用前加PMSF及磷酸化蛋白酶抑制剂)提取各组细胞总蛋白，BCA法测定总蛋白浓度，蛋白样品加入上样缓冲液后，沸水浴5 min以制备蛋白印迹上样样品，并进行SDS-PAGE凝胶电泳，随后转移至PVDF膜上，将膜放入5%脱脂奶粉中封闭1 h，β-actin、GAPDH、RhoA、p21、Cdk2、p-Cdk2一抗在4 ℃下孵育过夜，洗膜后加入山羊抗兔二抗孵育1 h，再将PVDF膜浸没在ECL发光液中5 min，置于Chemic DocTMXRS+成像仪上成像。以β-actin、GAPDH为内参，采用Image Lab软件分析RhoA、p21、Cdk2、p-Cdk2蛋白条带灰度值，每组3个复孔，重复3次。

表1 引物序列

3 结果

3.1 四君子汤含药血清对IEC-6细胞增殖的影响 图1显示，与对照组比较，给药24 h后腐胺组及10%、20%四君子汤含药血清组细胞增殖活力增加(P<0.01)，给药48、72 h后腐胺组及各剂量四君子汤含药血清组细胞增殖活力均增加(P<0.01)。与对照组比较，给药48、72 h后，多胺合成抑制剂DFMO可降低细胞增殖活力(P<0.01)；与DFMO组比较，给药48 h后腐胺组及各剂量四君子汤含药血清组可逆转DFMO所致的细胞增殖活力降低(P<0.01)，而给药72 h后腐胺组及10%、20%四君子汤含药血清组亦可逆转DFMO所致的细胞增殖活力降低(P<0.01)。

3.2 四君子汤含药血清对RhoA蛋白表达的影响 图2显示，与对照组比较，腐胺组及10%、20%四君子汤含药血清组可升高RhoA蛋白表达(P<0.05，P<0.01)，而DFMO组可抑制其蛋白表达(P<0.05)；与DFMO组比较，腐胺组及四君子汤各剂量含药血清组可逆转DFMO对RhoA蛋白表达的抑制作用(P<0.01)。

3.3 四君子汤含药血清对p21、Cdk2 mRNA和蛋白表达的影响 图3显示，与对照组比较，腐胺组及四君子汤各剂量含药血清组可抑制p21 mRNA和蛋白表达(P<0.05，P<0.01)，而腐胺组及10%、20%四君子汤含药血清组可升高Cdk2 mRNA和蛋白表达(P<0.05，P<0.01)。图4显示，与对照组比较，DFMO组可升高p21 mRNA和蛋白表达(P<0.01)，抑制Cdk2 mRNA和蛋白表达(P<0.05，P<0.01)；与DFMO组比较，腐胺组及10%、20%四君子汤含药血清组可逆转DFMO所致的p21 mRNA和蛋白表达升高(P<0.05，P<0.01)及Cdk2 mRNA和蛋白表达降低(P<0.05，P<0.01)。

3.4 四君子汤含药血清对p-Cdk2蛋白表达的影响 图5显示，与对照组比较，腐胺组及四君子汤各剂量含药血清组可提高p-Cdk2蛋白表达(P<0.05，P<0.01)，而DFMO组可降低其蛋白表达(P<0.01)；与DFMO组比较，腐胺组及四君子汤各剂量含药血清组可逆转DFMO对p-Cdk2蛋白表达的抑制作用(P<0.01)。

4 讨论

中医“四季脾旺不受邪”“内伤脾胃，百病由生”等理论与胃肠黏膜保护功能相关，胃肠黏膜保护是中医“脾”功能的重要内容。有研究表明，非器质性病变脾虚患者可见胃肠黏膜损伤的病理改变，其十二指肠及胃上皮细胞出现坏死，脱落等症状[15-16]。四君子汤由人参、白术、茯苓、甘草等比例组方，方中人参为君药，甘温益气，养胃健脾；臣以苦温之白术，健脾燥湿；佐以甘淡茯苓，健脾渗湿，茯苓白术配伍，则健脾祛湿之功益著；炙甘草为使，益气和中，调和诸药，诸药配伍，具有益气健脾之功效，可改善患者的脾胃功能，缓解消化性溃疡患者症状，促进病灶愈合[17-18]。前期研究表明四君子汤通过影响多胺调控细胞迁移过程而促进胃肠黏膜损伤修复[9-10]，但其对上皮细胞增殖过程作用机制研究较少。本研究发现，四君子汤含药血清对不同时间点细胞增殖都有促进作用。DFMO可减少多胺的生物合成，目前常用于多胺信号通路相关研究[3]。本研究发现，多胺合成抑制剂DFMO可抑制小肠上皮细胞增殖，四君子汤含药血清可逆转DFMO对细胞增殖的抑制作用，该作用与腐胺(外源性多胺)作用相似,提示四君子汤可影响多胺促进正常小肠上皮细胞增殖。

RhoA是Rho家族成员之一，调控细胞骨架重建过程[19]，在黏膜损伤早期修复过程中，多胺可通过增加钙离子浓度、提高RhoA蛋白表达而促进上皮细胞迁移过程，加入DFMO后，则可降低钙离子浓度，抑制RhoA蛋白表达而阻滞细胞迁移[20]。p21是细胞周期蛋白依赖性激酶的抑制因子之一，在黏膜损伤后修复过程中，多胺可通过上调c-Myc表达而抑制p21蛋白表达，促进小肠上皮细胞增殖过程[21]。Cdk2是细胞周期蛋白依赖性激酶成员之一，对细胞周期的调控有重要作用，Thr160位点的磷酸化为其活性形式。过表达RhoA可提高Cdk2表达及活性而促进小肠上皮细胞增殖[6]。研究发现，多胺合成减少可引起p21表达升高，增加其与细胞周期蛋白依赖性激酶(Cdk2、Cdk4等)复合物的形成，最终降低Cdk2、Cdk4蛋白活性而抑制正常小肠上皮细胞增殖[8]。本研究发现，DFMO可抑制RhoA蛋白、Cdk2 mRNA和蛋白的表达，升高p21 mRNA和蛋白表达；四君子汤含药血清可逆转DFMO对RhoA蛋白和p21、Cdk2 mRNA和蛋白表达的作用。本研究还发现，四君子汤含药血清不仅可提高磷酸化Cdk2蛋白表达，还可逆转DFMO对Cdk2磷酸化水平的抑制作用。上述结果表明，四君子汤含药血清可能通过影响多胺上调RhoA蛋白及Cdk2表达，并提高Cdk2蛋白磷酸化水平，最终促进小肠上皮细胞增殖。

综上所述，四君子汤可作用于多胺信号通路，上调RhoA蛋白表达以及下调p21表达，从而提高Cdk2表达及其活性，最终促进正常小肠上皮细胞增殖。