赶黄草质量标准的研究

卢明辉， 杜泽南， 马雪祺， 李永康， 陈军峰， 孙连娜*

(1.上海中医药大学中药学院，上海 201203；2.上海中医药大学中药研究所，上海 201203)

赶黄草PenthorumchinensePursh.为虎耳草科扯根菜属植物扯根菜的干燥地上部分，具有利水除湿、活血散瘀、止血、解毒等多种功效，主治黄疸、水肿、跌打损伤[1]。肝苏颗粒是赶黄草单方制剂[2]，临床常用于治疗慢性活动性肝炎、乙型肝炎[3-4]，主要含有黄酮、酚酸、木脂素等成分[5]，以黄酮苷(尤其是黄酮苷)为母核，连接没食子酰基并成环的大环多酚为主要活性成分，如乔松素-7-O-β-D-葡萄糖苷、乔松素-7-O-[4″,6″-(S)-六羟基联苯二酰基]-β-D-葡萄糖苷(PHG)、乔松素-7-O-[3″-O-没食子酰基-4″,6″-(S)-六羟基联苯二酰基]-β-D-葡萄糖苷(PGHG)[6-8]，具有保肝、抗肝损伤、降糖等多种作用[9-14]。但目前仅2009年版《湖南省中药材标准》[15]和2010年版《四川省中药材标准》[16]收载赶黄草质量标准，并且前者只规定性状和水分，而后者只以槲皮素为指标，不能全面反映药材内在质量。因此，本实验选择乔松素-7-O-β-D-葡萄糖苷、PHG、PGHG、thonningianin A作为指标成分，采用显微鉴别、TLC、HPLC法对赶黄草进行定性鉴别和含量测定，并对水分、总灰分、酸不溶性灰分进行检查，初步制定检测限度，以期为完善该药材质量标准提供依据。

1 材料

Agilent 1260高效液相色谱仪，配置DAD紫外检测器、Chemstation色谱工作站(美国Agilent公司)；XS105DU电子天平(瑞士梅特勒-托利多公司)；HSW-24四孔水浴锅、SY-360H超声仪(上海诚献仪器设备有限公司)；DHG-9053A鼓风干燥箱(上海一恒科学仪器有限公司)；DL-I-15台式封闭电炉(天津恒瑞科教仪器有限公司)；Motic BA210正置生物显微镜(麦克奥迪实业集团有限公司)；ATS 4全自动点样仪(瑞士Camag公司)。

TLC Silica gel 60 RP-8 F254S薄层板(德国Merck公司)；高效硅胶G预制板(烟台市化学工业研究所、烟台江友硅胶开发有限公司)；HPMN正相硅胶薄层板(德国Macherey Nagel公司)。乔松素-7-O-β-D-葡萄糖苷、PHG、PGHG、thonningianin A对照品均为课题组前期从赶黄草中分离纯化所得，纯度均在98%以上。

色谱纯乙腈(美国Fisher公司)；色谱纯甲酸(上海麦克林生化科技有限公司)；分析纯乙腈、甲醇、95%乙醇(上海泰坦科技股份有限公司)；水为超纯水(Milli-Q超纯水仪处理)。

赶黄草共15批，经上海中医药大学孙连娜老师鉴定为正品，具体信息见表1。

表1 样品信息

2 方法与结果

2.1 显微鉴别 对药材茎横切面(临时水装片)及粉末(水合氯醛装片)的相关显微特征进行鉴别，结果见图1～2。由此可知，横切面表皮细胞1列，偶见棕色块状物；表皮下方多列厚角细胞，气室约3列，被单列厚角细胞隔开；韧皮部窄，形成层可见；木质部由导管、纤维组成，射线平直，由1～2列细胞组成；髓部细胞类圆形；厚角细胞、韧皮薄壁细胞均含草酸钙簇晶，簇晶直径20～50 μm；粉末黄绿色，表皮细胞多角形，部分含有棕黄色物质，气孔不定式，含晶鞘纤维和螺纹导管。

2.2 TLC鉴别

2.2.1 检测波长、载体确定 分别对254、365 nm检测波长及反向C18薄层板、高效硅胶G预制板进行考察，发现以反向C18薄层板为载体时，在254 nm波长处PHG、PGHG、thonningianin A 斑点清晰；以高效硅胶G预制板为载体时，在365 nm波长处乔松素-7-O-β-D-葡萄糖苷斑点明显，鉴别效果更佳。

2.2.2 展开体系优化 考察乙腈-水(1∶1)、乙腈-水-甲酸(5∶5∶1)、乙腈-水-甲酸(9∶11∶2)、二氯甲烷-甲醇-甲酸(7∶1∶0.1)、石油醚-乙酸乙酯(1∶5)、二氯甲烷-甲醇(5∶1)，发现在乙腈-水-甲酸(9∶11∶2)体系下，PHG、PGHG、thonningianin A 斑点分离理想，Rf值适中；在二氯甲烷-甲醇-甲酸(7∶1∶0.1)体系下，斑点分离完全，乔松素-7-O-β-D-葡萄糖苷斑点清晰。

2.2.3 耐用性考察 考察不同品牌薄层板(银龙牌硅胶HSG预制板、黄海牌硅胶HSG预制板、MachereyNagel牌)、温度(4、22 ℃)、相对湿度(30%、70%)，发现上述条件均对展开结果影响不明显，表明该方法耐用性良好。

2.2.4 鉴别方法 取药材粉末1 g，置于50 mL具塞锥形瓶中，加80%甲醇25 mL，超声提取15 min，取出，滤过，取续滤液10 mL，蒸干，残渣加2 mL甲醇溶解，作为供试品溶液；精密称取各对照品适量，置于量瓶中，80%甲醇定容，分别制成每1 mL含乔松素-7-O-β-D-葡萄糖苷、PHG、PGHG、thonningianin A各1 mg的溶液，作为对照品溶液。按照2020年版《中国药典》薄层色谱法(通则0502)，吸取供试品、乔松素-7-O-β-D-葡萄糖苷对照品溶液各2 μL，分别点于同一高效硅胶G薄层板上，以二氯甲烷-甲醇-甲酸(7∶1∶0.1)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以5%三氯化铝乙醇溶液，晾干，热风吹至斑点显色清晰，在紫外光(365 nm)下检视，结果见图3A；吸取供试品溶液和其他3种对照品溶液各2 μL，点于同一反相薄层板上，以乙腈-水-甲酸(45∶55∶10)为展开剂，展开，取出，晾干，在紫外光(254 nm)下检视，结果见图3B～3D。由此可知，供试品溶液色谱在与对照品溶液色谱相应位置上显相同颜色荧光斑点，而且其清晰，分离度良好。

2.3 水分、总灰分、酸不溶性、50%乙醇浸出物含量测定 采用2020年版《中国药典》四部方法测定，结果见表2。

表2 水分、总灰分、酸不溶性、50%乙醇浸出物含量测定结果

2.4 各成分含量测定 参考文献[17]报道。

2.4.1 色谱条件 Agilent Zorbax SB-C18色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流动相乙腈(A)-0.5%甲酸(pH=2.38)(B)，梯度洗脱(0～10 min，28%～30%A;10～20 min，30%～36%A；20～22 min，36%～39%%A；22～30 min，39%～40%A；30～35 min，40%～90%A；35～37 min，90%～28%A；37～40 min，28%A)；体积流量1 mL/min；柱温30 ℃；检测波长280 nm；进样量10 μL。

2.4.2 对照品溶液制备 精密称取乔松素-7-O-β-D-葡萄糖苷、PHG、PGHG、thonningianin A对照品适量，80%甲醇制成质量浓度分别为0.259 2、0.610 4、0.604 4、0.485 2 mg/mL的溶液，即得。

2.4.3 供试品溶液制备 精密称取药材粉末(过3号筛)1.0 g，置于250 mL具塞锥形瓶中，精密加入100 mL 80%甲醇，称定质量，回流提取1 h，取出，放凉，80%甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，0.45 μm微孔滤膜过滤，取续滤液，即得。

2.4.4 系统适应性考察 取对照品、供试品溶液适量，在“2.4.1”项色谱条件下进样测定，结果见图4。由此可知，各成分色谱峰周围无干扰峰，与其他峰完全分离(分离度>1.5)，理论塔板数以乔松素-7-O-β-D-葡萄糖苷计，不低于7 000。

2.4.5 线性关系考察 精密量取对照品溶液适量，逐级稀释，定容，制得6个质量浓度，在“2.4.1”项色谱条件下进样测定。以对照品峰面积为纵坐标(Y)，进样量为横坐标(X)进行回归，结果见表3，可知各成分在各自范围内线性关系良好。

2.4.6 方法学考察 参照文献[17]报道的方法，进行精密度、稳定性、重复性、加样回收率试验，发现所得结果均符合分析要求。

2.4.7 样品含量测定 取15批药材，按“2.4.3”项下方法制备供试品溶液，在“2.4.1”项色谱条件下进样测定，计算含量，结果见表4。

表3 各成分线性关系

表4 各成分含量测定结果(mg/g，n=3)

3 讨论

3.1 定性鉴别 乔松素-7-O-β-D-葡萄糖苷极性与PHG、PGHG、thonningianin A相差较大，同时在正向、反向薄层板展开分离的效果均不理想，故本实验分别采用高效硅胶G薄层板、反向薄层板对上述4种成分进行鉴别。

3.2 检查项限量 15批赶黄草水分、总灰分、酸不溶性灰分含量范围分别为6.07%～9.55%、5.36%～7.97%、0.07%～0.23%，结合平均值，暂定三者分别不得超过13.0%、9.0%、1.0%。

3.3 浸出物限量 本实验分别考察了水溶性、醇溶性、50%乙醇浸出物的得率，发现50%乙醇浸出物最高，故选择其作为浸出物限量考察指标，暂定不得低于15.0%。

3.4 各成分含量限度 结合表4结果，暂定以干燥品计，乔松素-7-O-β-D-葡萄糖苷、PHG、PGHG、thonningianin A含量分别不得低于0.07%、0.50%、0.60%、0.50%。

4 结论

本实验选择乔松素-7-O-β-D-葡萄糖苷、PHG、PGHG、thonningianin A作为赶黄草指标成分，HPLC法测定其含量，可为该药材质量控制奠定基础。由于基地化管理使赶黄草净度提升，故其酸不溶性灰分限量提升至不超过1.0%，结合活性成分性质，建议以50%乙醇为溶剂考察浸出物。