低温干旱复合胁迫对8个紫花苜蓿品种形态和生理特征的影响

方明月，汪溢磐，赵 奕，热孜亚·艾力，申玉华，张铁军*

(1.北京林业大学草业与草原学院，北京 100083；2.赤峰学院化学与生命科学学院，内蒙古 赤峰 024000)

紫花苜蓿(Medicagosativa)是一种优良的多年生豆科(Leguminosae)牧草，具有产草量高、适应性好、利用年限长、再生性强、营养丰富等特点[1]，有“牧草之王”的美称。紫花苜蓿在我国的栽培历史悠久，近年来，在政策扶持和市场需求拉动下，苜蓿种植面积迅速增加，现已成为了植物性蛋白饲料行业的主力军，在畜牧业生产中占据重要地位[2]。

紫花苜蓿主要种植于我国的西北、东北、华北和江淮流域等地区，截止到2020年底，全国紫花苜蓿年末保留面积3 310.01万hm2，种植面积前5位省区为甘肃、内蒙古、宁夏、陕西和新疆(含新疆兵团)，占总面积的89.8%[3]。但我国北方特别是西北地区降雨稀少、水资源匮乏，加之冬季寒冷，低温干旱的环境条件常常使紫花苜蓿出现减产、无法越冬等问题，造成经济损失的同时也影响了苜蓿草地的可持续利用[4-5]。因此，为满足国内苜蓿种植对苜蓿良种的需求，我国近几年大量从国外进口苜蓿种子。这些引进品种虽然暂时缓解了苜蓿种子短缺的困局，但我国气候条件与许多苜蓿品种来源地区有较大不同，盲目引种及系统性研究评价的缺乏给农民和相关企业造成诸多损失。

目前，国内外大多数研究集中于干旱、低温单因素胁迫对紫花苜蓿生长和发育的影响，杨姝等[6]从27个苜蓿种植资源中选取了4个强抗旱种质材料，认为选育抗旱苜蓿品种的有效途径是充分发掘地方苜蓿种质资源；Ni等[7]研究发现，紫花苜蓿表皮蜡质由伯醇、烷类、萜类等构成，并可通过改变叶表皮蜡质的含量、成分或结构来提高抗旱性；Castonguay等[8]研究认为，提高苜蓿耐寒性尤其是改良高秋眠级品种耐寒性是提高苜蓿产量的有效方式。秋眠与耐寒性密切相关，充分认识低温驯化过程中苜蓿生长与耐寒性调控的分子机理，以分子育种方法改良苜蓿耐寒性是可行的[9]。然而，低温干旱复合胁迫对牧草生长的研究相对较少。梁小红等[10]研究发现多年生黑麦草对低温干旱复合胁迫具有交叉适应的能力，进行适度的干旱处理能提高其在低温环境下的适应性和越冬成活率。刘杰等[11]以不同基因型的两个小黑麦品种为试验材料，发现低温、干旱和复合胁迫对小黑麦草幼苗生理特性有着不同程度的影响，且复合胁迫可能对植物会出现协同效应或拮抗效应，不能视作是简单的叠加效应。徐洪雨等[12]通过控温和更换表土试验模拟低温干旱环境，发现紫花苜蓿根颈内的脯氨酸和可溶性蛋白含量可能与其耐寒性有关，同时可溶性糖含量低是苜蓿根颈失水速率快乃至耐寒性受到严重影响的原因。

因此，关于低温干旱复合胁迫对紫花苜蓿影响的研究相对较少。本研究将以代表性的国内苜蓿品种和引进苜蓿品种为试验材料，通过对低温干旱复合胁迫下紫花苜蓿表型及生理指标的测定，系统分析比较8个紫花苜蓿品种在低温干旱环境下的抗逆性，以期为我国北方地区的紫花苜蓿品种选择和新品种培育提供理论指导。

1 材料与方法

1.1 材料来源与处理

引进国内外代表性抗寒紫花苜蓿品种共8个，以东北地区的重要品种‘公农1号’(Medicagosativa‘Gongnong No.1’)为对照。品种名称和来源见表1。

表1 供试品种名称及来源

1.2 试验方法

从每份紫花苜蓿品种材料中挑选180粒均匀一致、颗粒饱满、无病虫害的种子，先用HgCl2溶液消毒8分钟，再用蒸馏水冲洗5次后置于内铺滤纸的培养皿中。于人工气候箱中培养发芽，培养条件为昼/夜温度为25℃/20℃，湿度为70%，光照/黑暗时间为12 h/12 h，光照强度为5 000 lx。

每份苜蓿品种材料均设置对照组和胁迫处理组，每组设置3次重复，即每份材料种植6盆，共48盆。待幼根长至1～2 cm时，选择长势较好的幼苗移栽至花盆中，每个花盆移植17株。移植前，试验所用的塑料花盆及蛭石均进行高温灭菌处理，并在每个盆内装入等量均匀的蛭石约45 g。移植后花盆内土壤含水量保持在田间持水量的75%～80%，每周加入2～3次速效肥(品牌为Peters professional，成分为20∶20∶20氮磷钾肥)，每次每盆0.1 g。待生长到4～5片复叶时，进行胁迫处理。

目前研究干旱胁迫对植物影响试验最常用的干旱处理方法是反复干旱法[13,14]，本试验采用两次干旱低温复合胁迫处理来进行抗逆性鉴定。胁迫处理期间，对照组始终置于人工培养箱中，培养条件同发芽期，土壤含水量保持在田间持水量的70%～80%。处理组第一次停止供水直至土壤含水量降至田间持水量的15%～20%，持续胁迫8 d。随后转入4℃低温培养箱进行低温干旱复合胁迫，持续5 d，培养条件为昼夜温度为4℃，空气湿度为70%，光照/黑暗时间为12 h/12 h，光照强度为5 000 lx。然后，将其转入人工培养箱并复水，使其土壤水分达到田间持水量的75%～80%。复水后第二次停止供水，方法同第一次。干旱胁迫持续8 d后再次转入4℃低温培养箱，培养条件同上，低温干旱复合胁迫5 d后进行指标测定。

1.3 测定指标和方法

1.3.1表型指标的测定 试验结束后对所有处理进行取样，每盆随机选取3株幼苗，测量植株高度、叶长及叶宽。每盆选择3株与花盆中大部分幼苗长势相同的苜蓿幼苗，剪下称量其地上部鲜重，并于纸袋中自然风干后测量其地上部干重。计算各表型指标处理组相比对照组的降幅及相对鲜重、相对干重、相对鲜干比等3项指标，计算公式如下：

相对鲜干比=处理组鲜干比/对照组鲜干比×100%

1.3.2生理特征的测定 取样前，用手持叶绿素仪(中科维禾TYS-4 N)测量每个花盆中3株长势均匀植株的中部叶片的叶绿素含量及氮含量。过氧化物酶(Peroxidase,POD)活性采用过氧化物酶试剂盒(货号MM-35960O1，江苏酶免实业有限公司)测定，过氧化氢酶(Catalase,CAT)活性采用过氧化氢酶试剂盒(货号MM-0799O1，江苏酶免实业有限公司)测定。

1.3.3低温干旱复合胁迫条件下的抗逆性综合评价 采用隶属函数模糊综合评价法，对各品种紫花苜蓿在低温干旱复合胁迫条件下的抗逆性，进行综合评价。计算隶属函数值Xi和隶属函数总和(D)公式如下[5,15]:

式(1)

式(2)

式中i为指标，j为品种；Xi为处理组与对照组指标测定值的比值，Xmin、Xmax为此指标比值的最小值和最大值。综合评价D值越大表示该紫花苜蓿品种在低温干旱复合胁迫条件下抗逆性越强。

1.4 数据分析

采用SPSS25、DPS进行统计分析，使用Simpalot12.5作图。

2 结果与分析

2.1 低温干旱复合胁迫下不同品种紫花苜蓿幼苗表型特征的差异

紫花苜蓿的表型和生理均受到低温干旱复合胁迫的显著影响(P<0.05)，除了POD和CAT活性两项指标外，不同苜蓿品种的表型和生理指标存在显著差异(P<0.05)，品种与低温干旱复合处理的交互作用对苜蓿各项指标影响并不显著(表2)。

表2 低温干旱胁迫和品种及其交互作用对苜蓿生长影响的方差分析(F值)

8个紫花苜蓿品种在低温干旱复合胁迫和正常条件下，表型指标也有一定的差异(表3)。不同紫花苜蓿品种的株高在低温干旱复合胁迫条件下降幅差异较大，其中‘公农1号’的降幅最小，株高由平均20.39 cm下降为20.28 cm，降幅为0.54%(表3)。‘北林201’的降幅最大，株高由平均24.75 cm下降为17.26 cm，降幅达到30.28%。同时，低温干旱复合胁迫对‘北极熊’及‘北林201’的株高存在显著影响(P<0.05)，对‘WL298’的株高存在极显著影响(P<0.01)，对其他品种的株高影响不显著。

表3 不同紫花苜蓿品种在低温干旱复合胁迫和正常条件下的表型指标

紫花苜蓿的叶长降幅范围在0.47%～17.14%，其中‘东苜2号’‘龙牧803’的降幅均小于1%，‘龙牧803’的降幅最小，‘可汗’的降幅最大。叶宽的降幅范围与叶长相近，其中‘东苜2号’的降幅最小，仅为1.47%，‘WL168’的降幅最大，达到14.76%。低温干旱复合胁迫对‘北极熊’的叶长与叶宽均有显著影响(P<0.05)，同时对‘WL298’的叶长也有显著影响(P<0.05)。

8个紫花苜蓿品种的鲜重及干重降幅均较大，鲜重降幅平均为56.76%，干重降幅平均为52.72%。其中鲜重降幅最小的是‘东苜2号’，最大的是‘WL298’，干重降幅最小的是‘公农1号’，最大的是‘北林201’。同时，低温干旱复合胁迫对‘可汗’‘WL168’‘龙牧803’的鲜重均存在显著影响(P<0.05)，对‘北极熊’‘北林201’‘WL298’的鲜重存在极显著影响(P<0.01)。‘北极熊’的干重也受到低温干旱复合胁迫的显著影响(P<0.05)，‘WL298’‘WL168’的干重受其极显著影响(P<0.01)。

2.2 低温干旱复合胁迫下不同品种紫花苜蓿幼苗相对鲜重、干重和鲜干比的差异

2.2.1低温干旱复合胁迫下不同品种紫花苜蓿幼苗相对鲜重的差异 表4可知，8个紫花苜蓿品种在低温干旱复合胁迫条件下有个品种的相对鲜重无显著差异，按相对鲜重大小依次为‘东苜2号’‘公农1号’‘WL168’‘龙牧803’‘北林201’‘可汗’‘东苜2号’与‘北极熊’‘WL298’间存在显著差异(P<0.05)。其中，‘东苜2号’的相对鲜重最大，为53.35%；‘WL298’的相对鲜重最小，为37.06%，表明该品种在低温干旱复合胁迫下，鲜重下降幅度最大。

2.2.2低温干旱复合胁迫下不同品种紫花苜蓿幼苗相对干重的差异 8个紫花苜蓿品种中仅部分品种的相对干重在低温干旱复合胁迫条件下表现出显著差异(P<0.05，表4)，所有品种按相对干重大小依次为‘公农1号’‘东苜2号’‘可汗’‘WL168’‘北极熊’‘龙牧803’‘WL298’‘北林201’。其中，‘公农1号’的相对干重最大，为58.90%；‘北林201’的相对干重最小，为39.00%，表明该品种在低温干旱复合胁迫下，干重下降幅度最大。

2.2.3低温干旱复合胁迫下不同品种紫花苜蓿幼苗相对鲜干比的差异 表4可知，8个紫花苜蓿品种在低温干旱复合胁迫条件下相对鲜干比无显著差异(表4)，且按鲜干比大小排名为‘北林201’>‘东苜2号’>‘龙牧803’>‘ WL168’> ‘WL298’>‘北极熊’>‘可汗’>‘公农1号’。8个紫花苜蓿品种中，‘北林201’的相对鲜干比最大，为96.49%；‘公农1号’的相对鲜干比最小，为80.39%，表明该品种在低温干旱复合胁迫下，相对鲜干比下降幅度最大。

表4 低温干旱复合胁迫下不同紫花苜蓿品种相对鲜重、干重和鲜干比分析

因此，在低温干旱复合胁迫条件下，与对照组相比，紫花苜蓿的干、鲜重及鲜干比均有较大下降幅度，但大部分品种间无显著差异。

2.3 低温干旱复合胁迫下不同品种紫花苜蓿幼苗生理特征的差异

紫花苜蓿的叶绿素受到品种和低温干旱复合胁迫的显著影响(P<0.05，表2)，但两者的交互作用对其影响并不显著。其中，低温干旱复合胁迫对其叶绿素含量影响最小的是‘北极熊’与‘WL168’，与对照组相比叶绿素含量仅下降了0.63%，0.85%。影响最大的是‘北林201’与‘可汗’，与对照组相比叶绿素含量下降了25.98%，20.61%(图1A)。

紫花苜蓿的氮含量受到品种和低温干旱复合胁迫的显著影响(P<0.05，表2)，低温干旱复合胁迫对其影响最小的是‘北极熊’与‘WL168’，与对照组相比,氮含量仅下降0.12%，0.16%。影响最大的是‘北林201’与‘可汗’，与对照组相比,下降了21.85%，17.15%(图1B)。

紫花苜蓿的POD仅受到低温干旱复合胁迫的显著影响(P<0.05，表3)，品种及两者的交互作用对其影响并不显著。其中，受低温干旱复合胁迫影响最小的是‘北极熊’与‘北林201’，与对照组相比其POD值仅下降7.95%，27.47%。影响最大的是‘龙牧803’与‘公农1号’，下降了54.66%，48.45%(图1C)。

紫花苜蓿的CAT仅受到低温干旱复合胁迫的显著影响(P<0.05，表2)。其中低温干旱复合胁迫对其CAT值影响最小的是‘可汗’与‘北极熊’，分别仅下降0.95%，3.53%。影响最大的是‘WL168’与‘北林201’，其CAT值下降了48.82%，48.03%(图1D)。

图1 干旱胁迫对不同品种苜蓿幼苗生理特征的影响

2.4 低温干旱复合胁迫条件下紫花苜蓿抗逆性评价

根据隶属函数D值，对8个品种紫花苜蓿在低温干旱复合胁迫条件下的抗逆性进行综合排序(表5)。在低温干旱复合胁迫条件下，紫花苜蓿抗逆性强弱的排名为‘东苜2号’>‘北极熊’>‘公农1号’>‘龙牧803’>‘WL168’>‘ WL298’>‘可汗’>‘北林201’。其中，表型指标综合评价指数最高的是‘东苜2号’，生理指标综合评价指数最高的是‘北极熊’。

表5 紫花苜蓿品种的综合评价指数

2.5 隶属函数与其他指标的相关性分析

利用双变量Pearson相关系数法对紫花苜蓿隶属函数D值与试验所测抗逆性评价指标进行相关性分析。结果表明，隶属函数D值与株高、叶绿素含量、氮含量均呈显著相关关系，干重与株高、叶长与叶宽呈显著相关关系，叶绿素与氮含量呈极显著相关关系(表6)。

表6 低温干旱复合胁迫下紫花苜蓿各指标的相关系数

3 讨论

3.1 低温干旱复合胁迫对紫花苜蓿幼苗形态特征的影响

形态学指标是植物抗逆性鉴定中应用较多的指标，株高、叶长、叶宽等形态指标能较直观、快速地反映植株生长状况和对逆境胁迫的敏感程度[16-17]。薛琪等[18]研究发现水分胁迫会引起植株个体对水分的竞争，最终影响地上部分茎、叶的生长，干旱条件下苜蓿品种的株高增幅与对照组相比均有下降。王晓龙等[19]研究表明，株高较低的苜蓿品种秋眠级低，耐寒性较强。本试验对不同紫花苜蓿品种采取低温干旱复合胁迫处理，发现，处理后各苜蓿品种的株高与对照组相比均有所下降，但不同品种间的降幅差异较大。综合评价后抗逆性较好的‘东苜2号’和‘公农1号’降幅均在3%内，但抗逆性较好的‘北极熊’降幅却达到了近20%。因此，株高是否可以作为苜蓿在低温干旱复合胁迫条件下的鉴定指标，还有待进一步研究确定。

鲜重、干重作为体现植株生物量的主要指标，能反应植物的物质能量积累[20]。而鲜干比则可用来衡量苜蓿品质，体现牧草的干物质积累程度及其利用价值，苜蓿的鲜干比越高，则其品质越好[21]。在低温、干旱这两种不利环境下，紫花苜蓿的鲜、干重均反应敏感，呈下降趋势[22-23]，这与本试验的结论较为一致。薛琪等[18]通过对不同紫花苜蓿品种在低温、干旱这两种不利环境下鲜干比的变化研究，发现植物可以通过降低鲜干比来储存体内营养物质,以度过逆境时期，且鲜干比下降幅度越大，抗寒性和抗旱性越弱,其中‘WL168’在干旱及低温环境中鲜干比所受影响均较小，其抗寒性和抗旱性均较强。但在本试验8个品种低温干旱复合胁迫的条件下，‘WL168’品种的抗逆性综合评价排名却并不高，仅为第5。同时，在本试验中鲜干比降幅最小的品种为抗逆性较差的‘北林201’。由此看见，单一胁迫条件(低温、干旱)下抗逆性强的品种在复合胁迫条件下不一定抗逆能力好，且在多重逆境下植物的鲜干比与抗逆性间的关系更为复杂，不呈现出单一的正相关关系。

3.2 低温干旱复合胁迫对紫花苜蓿幼苗生理特征的影响

光合作用是植物维持生长及进行物质代谢的最基本活动，而叶绿素是植物进行光合作用时所需的核心物质[24]，通过分析不同紫花苜蓿品种的叶绿素含量与其在低温干旱复合胁迫条件下的抗逆性的关系，可用于指导鉴定耐低温干旱型的苜蓿品种。近年来，叶绿素含量作为反应植物抗逆性的有效指标[25-26]，在紫花苜蓿的抗旱性及抗寒性相关研究中得到广泛应用[24,27-28]。本试验结果显示，紫花苜蓿在低温干旱复合胁迫条件下抗逆性综合评价与叶绿素含量显著相关，抗逆性强的品种叶绿素在逆境胁迫中下降幅度更小，这与余玲等[29]在紫花苜蓿的抗旱性研究中得出的结果一致，抗旱性强的品种能表现出较强的维持叶绿素含量的能力。同时，在本试验中紫花苜蓿的抗逆性综合评价与氮含量呈显著相关关系，这可能说明氮含量会影响紫花苜蓿在低温干旱环境中的抗逆能力。但这在之前的试验研究中尚未报道，氮含量能否作为紫花苜蓿在低温干旱复合胁迫条件下的鉴定指标，还有待进一步研究确定。

植物体内的过氧化物酶(POD)和过氧化氢酶(CAT)可以协同作用消除过氧化氢清除自由基以此来防止膜脂过氧化[30-31]，对植物细胞起到保护作用，同时提升植物抵抗逆境的能力[32]。研究表明，紫花苜蓿在低温或干旱逆境条件下，体内的POD和CAT含量会随着胁迫加剧呈先上升后下降的趋势，这是由于在逆境胁迫下，植物会形成POD和CAT等抗氧化酶来降低伤害[32-33]。本试验并未对紫花苜蓿在复合胁迫条件下POD、CAT含量的动态变化进行测定，仅测定了低温干旱复合胁迫后的最终含量。试验结果表明，胁迫处理后的各紫花苜蓿品种相比对照组体内POD、CAT含量均有所降低，与之前的研究结论较为一致。

3.3 紫花苜蓿低温干旱环境中抗逆性的综合评价

植物在低温干旱环境下的抗逆性是受多种因素共同影响的，不能根据单一指标来对其进行抗逆评价[34]。本试验选取了9个抗逆性指标通过隶属函数值法对8个紫花苜蓿品种进行综合客观的评价排序，结果表明‘东苜2号’‘公农1号’在低温干旱环境下的抗逆性较强。

4 结论

在低温干旱环境下，各紫花苜蓿品种的形态及生理指标均呈下降趋势。同时，基于双变量Pearson相关系数法，发现隶属函数与株高、叶绿素含量和氮含量均呈显著相关关系，表明紫花苜蓿在低温干旱复合胁迫下的抗逆性与这三个指标显著相关。对9个指标的隶属函数值综合指数发现，在低温干旱环境下的抗逆性表现为‘东苜2号’>‘北极熊’>‘公农1号’>‘龙牧803’>‘WL168’>‘ WL298’>‘可汗’>‘北林201’。这对我国北方地区紫花苜蓿栽培品种的选择具有重要参考价值。