紫花苜蓿种子内生根瘤菌定位及灭菌方法研究

何 龙，师尚礼，康文娟，刘旵旵，王文娟，武 蓓

(甘肃农业大学草业学院/草业生态系统教育部重点实验室/中-美草地畜牧业可持续发展研究中心，甘肃 兰州 730070)

植物内生菌是一类能在植物组织中定殖、运转和生存，但不引起宿主植物病害症状的微生物[1]。研究表明，内生菌广泛存在于玉米(ZeamaysL.)[2]、水稻(OryzasativaL.)[3]、烟草(NicotianatabacumL.)[4]、苜蓿(MedicagosativaL.)[5]等多种植物的根、茎、叶组织和种子内[6]。苜蓿是优质的豆科牧草，蛋白含量高，与根瘤菌形成根瘤后可将大气中的无机氮转化为有机氮，供给植物营养[7]。苜蓿-根瘤菌共生体系的固氮作用不仅具有巨大的经济效益，同时在提高作物和牧草产量与质量、改善生态环境和土壤肥力等方面具有重要作用[8]。但在构建共生固氮体系的过程中，萌发的种子胚根首先接触内生根瘤菌，然后才能接触到外源接种的根瘤菌，内生根瘤菌对于外源根瘤菌接种效果产生干扰[9]。因此，种子内生根瘤菌的有效灭除对外源接种根瘤菌的高效固氮及促生效应研究具有重要意义。

在根瘤菌接种过程中，菌类污染是常见且必须高度重视的问题，其污染来源一般可分为材料带菌、接种过程污染和生长过程污染等方面[10]。接种过程和生长过程中的菌类污染可以通过无菌操作来避免，但材料带菌只能通过灭菌来消除[11]，对材料进行灭菌处理时还要兼顾灭菌方法对种子发芽率、幼苗生长和操作人员的安全等的影响[12]。目前对苜蓿种子的灭菌主要采用0.1%升汞、98%浓硫酸、10%次氯酸钠和碘伏溶液等[12-16]其中一种或几种溶液进行漂洗，其中低浓度的Hg2+可与带负电荷的蛋白质结合，使细菌蛋白变性、酶失活，是一种剧毒的重金属盐杀菌剂，对操作人员健康和环境安全存在很大隐患[17]；浓硫酸的强酸性能够腐蚀种皮，打破栅栏组织屏障，使种壳变薄并消除珠孔等部位的堵塞物，增大种皮透性，促进吸水萌发[18]，但处理时间较难控制易造成酸害，废弃液存在安全隐患[19]。因此，研发高效安全的紫花苜蓿种子内生根瘤菌灭菌处理方法是苜蓿与根瘤菌精准匹配高效固氮效应研究的必要条件。

1 材料和方法

1.1 试验材料

1.1.1供试苜蓿种子 ‘甘农9号’紫花苜蓿(M.sativa‘Gannong No.9’)由甘肃农业大学教育部草业生态系统重点实验室提供。

1.1.2培养基 酵母甘露琼脂(Yeast mannitol agar，YMA)刚果红培养基：甘露醇10.0 g·L-1,NaCl 0.1 g·L-1,MgSO4·7H2O 0.2 g·L-1、酵母粉1.0 g·L-1,K2HPO40.5 g·L-1、琼脂15 g·L-1、0.5%刚果红液4 mL·L-1、蒸馏水1 000 mL·L-1，pH值7.0±0.1。

1.1.3灭菌试剂 碘伏(聚乙烯吡咯烷酮碘)消毒液：有效碘含量为0.45%～0.55% W/V(德州亿康消毒制品有限公司)。

氯化钠-吐温溶液(Sodium chloride-Tween solution，ST液)：0.9%无菌氯化钠溶液，0.5%吐温80(天津市北联精细化学品开发有限公司)。

10%次氯酸钠溶液：购自天津市北辰方正试剂厂。

3%次氯酸钠溶液：将浓度为10%的次氯酸钠加入蒸馏水稀释至3%。

1.2 试验方法

1.2.1种子灭菌

(1)种子解剖

选取籽粒饱满、无病虫害[20]的‘甘农9号’种子1 200粒，其中150粒在无菌解剖镜(MOTIC体视显微镜SMZ-171)下，用无菌手术刀及解剖针将种子的种皮剖开，分离为种皮、胚、子叶、子叶+胚、子叶-胚连接处5个部位放置备用。

(2)灭菌处理

DF处理：碘伏浸泡6 min→无菌水冲洗。

DS处理：碘伏浸泡5 min→无菌水冲洗→ST液浸泡1 min→无菌水冲洗。

SH3处理：3%次氯酸钠浸泡6 min→无菌水冲洗。

SH10处理：10%次氯酸钠浸泡6 min→无菌水冲洗。

CK处理：无菌水浸泡6 min。

1.2.2种子内生根瘤菌数量测定 将挑选的种子10粒为一组，置于5个无菌三角瓶中，分别进行DF，DS，SH3，SH10和CK处理，备用。另取种皮、胚、子叶、子叶+胚、子叶-胚连接处5个部位，处理方法同上，备用。取上述备用材料，以10粒种子或种子部位为单位，将消毒后的种子加入无菌研钵中，加2 mL无菌水充分研磨后倒入2 mL离心管中，离心(4 000 r·min-1，10 min，4℃)后，配制成10-1，10-2，10-3，10-4，10-5浓度稀释液，每一浓度梯度3次重复，取上清液0.2 mL用涂抹法分别接种在YMA刚果红固体培养基上，置于28℃恒温恒湿培养箱(HHWS-II-400，上海跃进医疗器械有限公司)中培养48 h，参照霍平慧[21]的方法鉴别并记录每个培养皿中的根瘤菌数，以每平板30～300个菌落的稀释度计算1 mL稀释菌液的根瘤菌数[22]，单位为个·粒-1。计算公式为：1 mL稀释液含菌数=菌落平均数×稀释倍数×5。

1.2.3灭菌种子萌发能力检测 将挑选的种子以100粒为一组，置于5个无菌三角瓶中，分别进行DF，DS，SH3，SH10和CK处理灭菌后备用。另取500粒种子在无菌解剖镜下，用无菌手术刀及解剖针将种子的种皮剖开，以100粒为一组，置于5个无菌三角瓶中，对去皮种子分别进行DF，DS，SH3，SH10和CK处理灭菌。

在培养皿(直径90 mm)内放置两层滤纸并加入2 mL蒸馏水润湿，每个培养皿内均匀放置25粒灭菌后的完整种子或去皮种子，重复4次。置于25℃、日光照12 h的光照培养箱内连续培养一周，并记录发芽种子数、胚芽长、胚根长和幼苗长，并计算发芽率、发芽势、发芽指数和活力指数。

1.2.4指标测定 种子萌发的标准为胚根突破种皮，长出0.3 cm左右长的白色种根。

幼苗长度(Seedling length)(cm)=胚芽长+胚根长，随机从各处理中选取10株紫花苜蓿幼苗，测量幼苗从根基部到胚芽最高部位的绝对长度为胚芽长；测量根基部到根尖的长度为胚根长。

幼苗鲜重(Fresh weight)的测定：随机从各处理中选10株紫花苜蓿幼苗，滤纸吸干表面水分后称其鲜重。

活力指数(Vitality index)=S×Gi(S为幼苗平均长度)

1.3 数据处理

采用Excel 2019软件进行数据整理并用Prism 8软件作图；运用SPSS 25.0统计软件对数据进行LSD法比较分析种子部位和灭菌处理及二者交互作用对内生根瘤菌数量的影响，及不同处理对种子发芽及幼苗生长的影响。

2 结果与分析

2.1 不同灭菌处理对种子不同部位根瘤菌数量的影响

不同灭菌处理均降低了种子内生根瘤菌数量，DS处理可全面灭除种子内生根瘤菌。如图1所示，所有的部位在不同灭菌处理的内生根瘤菌数量均显著低于CK(P<0.05)。在4种灭菌处理间，种皮和子叶中，DF处理的内生根瘤菌数量显著高于其余处理(P<0.05)；胚中，SH10处理的内生根瘤菌数量著高于其余处理(P<0.05)；子叶+胚中，SH10处理的内生根瘤菌数量著低于DF，SH3处理(P<0.05)；种子中，DS处理的内生根瘤菌数量显著低于其余处理(P<0.05)，其余部位中灭菌处理间的内生根瘤菌数量差异不显著。

图1 种子不同部位在不同灭菌处理后的内生根瘤菌数量

在DF，DS，SH3和CK中，子叶+胚的内生根瘤菌数量显著高于其他部位(P<0.05)；在DF和CK中，胚的内生根瘤菌数量显著低于其他部位；SH10中，种子的内生根瘤菌数量显著高于其他部位(P<0.05)，其余处理中各部位间的内生根瘤菌数量差异不显著。

2.2 不同灭菌处理对种子发芽能力的影响

如图2所示，与CK相比，各灭菌处理均不同程度影响了紫花苜蓿种子的发芽率和发芽势。不同灭菌处理下，完整种子处理间的发芽率和发芽势差异不显著；去皮种子中，DS，SH3，SH10处理的发芽率显著高于CK(P<0.05)，同比增长124%，136%，244%，DF，DS，SH3，SH10处理的发芽势显著高于CK(P<0.05)，同比增长163%，300%，163%，655%。同一灭菌处理中，DF，DS，SH3和CK处理下完整种子的发芽率显著高于去皮种子(P<0.05)，同比增长188%，70%，61%，288%；DF，DS，SH3和CK处理下完整种子的发芽势显著高于去皮种子(P<0.05)，同比增长217%，109%，228%，763%。

图2 完整种子和去皮种子在不同灭菌处理下的发芽率、发芽势

如图3所示，与CK相比，各灭菌处理均不同程度影响了紫花苜蓿种子的发芽指数和活力指数。不同灭菌处理下，完整种子中，DF，DS和SH10处理的活力指数显著低于CK(P<0.05)，同比减少21.14%，15.17%，18.52%；去皮种子中，DS，SH3和SH10处理的发芽指数显著高于CK(P<0.05)，同比增长165.96%，116.20%，302.96%，SH10处理的活力指数显著高于CK(P<0.05)，同比增长77.8%。同一灭菌处理中，各处理完整种子的发芽指数和活力指数均显著高于去皮种子(P<0.05)。

图3 完整种子和去皮种子在不同灭菌处理下的发芽指数和活力指数

2.3 不同灭菌处理对幼苗长度的影响

如图4所示，与CK相比，各灭菌处理均不同程度影响了紫花苜蓿种子的胚芽长、胚根长和幼苗长。不同灭菌处理下，完整种子处理间的胚芽长、胚根长和幼苗长差异均不显著；去皮种子中，SH3处理的胚芽、胚根和幼苗长均显著低于CK(P<0.05)，分别同比减少50.39%，89.68%，77.98%，说明SH3灭菌处理对幼苗伸长的抑制效果最明显。同一灭菌处理中，各处理完整种子的胚芽长显著高于去皮种子(P<0.05)；DF，DS，SH3和SH10处理完整种子的胚根长和幼苗长显著高于去皮种子(P<0.05)。

图4 完整种子和去皮种子在不同灭菌处理下的胚芽长、胚根长和幼苗长

2.4 不同灭菌处理对幼苗生物量的影响

如图5所示，与CK相比，各灭菌处理均不同程度影响了紫花苜蓿种子的幼苗鲜重。不同灭菌处理下，完整种子中，DF处理的幼苗鲜重显著低于CK(P<0.05)，同比减少21.74%；去皮种子中，DF，SH3处理的幼苗鲜重显著低于CK(P<0.05)，分别同比减少38.06%，40.20%。同一灭菌处理中，SH3处理完整种子的幼苗鲜重显著高于去皮种子(P<0.05)，其余处理间差异不显著。

图5 完整种子和去皮种子在不同灭菌处理下的幼苗鲜重

3 讨论

3.1 苜蓿种子内生根瘤菌分布及不同灭菌方法对种子内生菌数量的影响

种皮、子叶、胚、子叶-胚连接处的内生根瘤菌分别占种子内生根瘤菌总量的23.47%，14.18%，6.11%，56.23%，与李剑峰[6]、张淑卿[23]等人的研究结果一致，即内生根瘤菌在苜蓿种子中主要存在于种皮及其空隙处，在子叶、胚中只有少量分布，研究进一步将内生根瘤菌定位至子叶-胚连接处。根瘤菌可以随苜蓿的生长被运送到营养器官或繁殖器官中[23]，种子作为繁殖器官是下一代新苜蓿内生根瘤菌的重要来源，苜蓿种子内生根瘤菌可为苜蓿-根瘤菌共生体系提供物质基础[24]。在种子内生根瘤菌灭菌，接种根瘤菌，构建高效共生固氮体系方面，子叶-胚连接处是灭菌的靶向部位，在紫花苜蓿根瘤菌的传代方面，子叶-胚连接处微环境适宜，是目的根瘤菌的最佳储存部位，但需要进一步利用标记菌株进行示踪试验。

紫花苜蓿种子在不同灭菌处理下的灭菌效果不同，其中紫花苜蓿种子的内生根瘤菌数量低于子叶+胚中的原因可能是种皮中的一些酚类化合物具有较高的抑菌活性[25]，可以抑制内生根瘤菌的繁殖，吸水后这些酚类化合物被释放出来降低了种子内生根瘤菌数量。在4种灭菌方法中，DF，DS灭菌效果比SH3，SH10好的的原因可能是碘伏和次氯酸钠的消毒原理不同，碘伏引起细菌芽孢发生肿胀、变形、凹陷或局部破核，使壳质层与皮质层的通透屏障破坏[26]，当溶液与种子接触时，能形成一层极薄的水溶性杀菌膜逐渐解聚释放出游离碘，从而达到持续灭菌的目的[27]；次氯酸钠通过水解形成次氯酸后又分解成新生态氧，新生态氧将菌体和病毒上的蛋白质氧化后变性从而杀死病原微生物[28]，在相同的灭菌时间中，碘伏可持续灭菌，拥有更好的灭菌效果。DS比DF灭菌效果更好可能是吐温-80本身具有一定的抑菌作用[29]，且ST液可提高消毒液的表面活性，增强消毒效果[23]，与碘伏搭配使用可以更好的达到灭菌目的。

3.2 不同灭菌方法对紫花苜蓿种子发芽及幼苗生长的影响

好的消毒方法需要满足两个条件：消灭种子内生根瘤菌和减少消毒试剂对种子的伤害。从整体上看，完整种子的发芽率、发芽势、胚芽长、胚根长、幼苗长和幼苗鲜重明显高于去皮种子。其原因可能是豆类植物种皮含有丰富的化合物，如黄酮、蛋白质、多肽、氨基酸、生物碱、类萜及类固醇等，这些化合物被种皮吸水释放后，能调控种胚的液态、气态微环境[30]，对种子有保护作用，能降低灭菌试剂对种子的伤害。在4种灭菌方法中，DF，DS灭菌处理的完整种子发芽及幼苗生长效果好于SH3，SH10灭菌处理，其原因可能是碘伏溶液是一种含碘的表面活性剂[31]，化学成分随载体的不同而变化[32]，可以刺激种子生长。DS处理的完整种子发芽及幼苗生长效果好于DF处理，其原因可能是ST液中吐温-80可以提高细胞通透性[33]，低浓度的氯化钠溶液可调节渗透压，促进种子吸水[34]，刺激发芽。在完整种子的不同灭菌处理中，种子发芽率均大于90%，除DF处理的胚芽长小于CK外，其余处理的胚芽长均大于CK，而所有处理胚根长均小于CK，说明吐温-80和次氯酸钠可以抑制胚根的生长，促进胚芽的生长。

4 结论

紫花苜蓿种子内生根瘤菌主要存在于子叶-胚连接处，当前研究表明相同处理时间下四种灭菌方式的灭菌效果不同，其中碘伏与ST液的联合灭菌效果优于单独使用碘伏或次氯酸钠，紫花苜蓿种子的最佳灭菌方式为碘伏浸泡5 min→无菌水冲洗→ST液浸泡1 min→无菌水冲洗。以后可通过控制灭菌时间开展紫花苜蓿种子内生根瘤菌灭菌效果研究，筛选最高效的灭菌方式。