2,4-表油菜素内酯对甜高粱和青贮玉米幼苗耐涝性的影响

苏 杭, 翟建荣, 邓苛莉, 栗 扬, 杨建峰, 綦 才, 郭彦军

(1.西南大学动物科学技术学院，重庆 400716；2.青岛农业大学草业学院，山东 青岛266109；3.西南大学农学与生物科技学院，重庆 400716)

甜高粱(SorghumsaccharatumMoench)与青贮玉米(Zeamays)是生产中使用较为广泛的C4禾本科(Gramineae)饲草作物，具有产量高、品质良、适口性好、种植地区广的特点[1-2]。然而，春播时作物将面临干旱问题，而夏播时(6月中下旬)，遇到短时间强降雨极易遭受涝害的影响,造成产量和品质的下降[3]。在水涝胁迫下，随着胁迫时间的延长，水中可溶性氧被消耗完，植物的根系处于低氧或缺氧环境中，有氧呼吸转换为无氧呼吸，产生酒精、乙酸等物质，对植物产生毒害作用[4]，使细胞气孔关闭、胞间CO2浓度和植物光合速率下降，最终导致植物产量下降[5]。为了尽早适应淹水胁迫，植物可通过改变根系形态，调节理化指标来提高缺氧条件下的生存能力，如促进植株偏上性和偏下性生长、不定根、通气组织的形成[6]。此外，在水涝胁迫下，细胞内自由基的产生和清除之间的平衡遭到破坏，大量O2-积累使丙二醛(Malonyldialdehyde，MDA)含量增加。植物为了缓解水涝胁迫对它的毒害作用，体内抗氧化酶，如超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，SOD)、过氧化物酶(Peroxidase，POD)、过氧化氢酶(Catalase，CAT)、抗坏血酸过氧化物酶(Aseorbateperoxidase，APX)活性增强，提高了清除活性氧自由基的能力，使膜脂过氧化降低，减少了相关代谢产物如MDA的积累。淹水胁迫下，植物体内游离脯氨酸含量的积累也被认为是植物对缺氧胁迫的生理适应[7]。一般情况下，短期水涝对植物造成的伤害较小；长期水涝导致根部厌氧呼吸产生大量乙醇、乙醛等物质，对细胞产生毒性。因此，如何提高植物苗期的抗涝性已成为生产中亟待解决的实际问题。

种子引发是指控制种子缓慢吸水，使种子进入萌动但胚根不突破种皮的阶段，然后再使种子缓慢回干的种子处理技术[8]。种子引发处理可以打破种子休眠，提升发芽速率和发芽率，促进幼苗生长[9]。种子引发还能提升种子在低温、涝害、干旱、盐碱等非生物胁迫环境中的抗逆性[10]。根据引发剂中溶质的不同可分为无机盐溶液引发、激素引发、营养引发等。2,4-表油菜内酯(2,4-epibrassionolide，EBR)是一种内源性多羟基甾体植物激素，在植物生长发育和逆境适应过程中有重要的作用[11]。EBR增强植物抗逆性的机制可能与其可以激活细胞合成自由基清除酶的能力有关。雷新慧等[12]的研究表明，使用0.1 μmol·L-1的EBR浸种12 h，显著增加荞麦(Fagopyrumesculentum)种子和幼苗叶片中SOD，POD，CAT活性，降低MDA含量，促进盐胁迫条件下荞麦种子发芽及幼苗生长。低氧胁迫下外源EBR处理显著提高了黄瓜(Cucumissativus)幼苗SOD和APX活性，降低了O2-，H2O2及MDA含量，增强了植株抗低氧胁迫的能力[13]。EBR通过调节大豆(Glycinemax)植株的渗透性和关键酶活性调节大豆的耐盐机制，缓解盐胁迫带来的伤[14]。然而，用EBR引发种子是否可以提高作物耐涝性，目前尚无相关研究报道。鉴于此，本试验用EBR引发甜高粱和青贮玉米种子，然后在苗期不同发育时期(一叶期、三叶期和五叶期)进行淹水处理，测定植物株高、干重、生物量、丙二醛和脯氨酸含量、抗氧化酶活性等，旨在揭示种子引发提高作物抗涝性的理化作用机制，为合理利用种子引发提高作物耐涝性提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

水淹试验中所用的青贮玉米种子来源于云南曲辰种业有限公司，品种为‘曲辰11’，为高淀粉玉米；甜高粱种子来源于北京克沃集团，品种为‘牧乐8 000’，是美国培育的高产甜高粱品种。

1.2 试验设计

选择大小均匀、籽粒饱满的种子(约2 000粒)，分别用0，0.001，0.01，0.1，1和10 μmol·L-1的2，4-表油菜素内酯(EBR)浸泡24 h。浸泡结束后取出，用蒸馏水将种子冲洗干净，用吸水纸擦去种子表面水分后在室温条件下自然风干，每12 h称重一次，直至种子重量回到引发前的原始重量备用(种子重量回到引发前的原始重量后将风干过程中萌发的种子弃掉)。其中0 μmol·L-1EBR为水引发处理，未浸泡种子为对照处理。

种子萌发试验在光照培养箱(RXZ-500A)进行。培养皿(12 cm×2.5 cm)底部铺设两层吸水滤纸，然后将种子整齐摆放于培养皿内，每个培养皿摆放甜高粱种子30粒，青贮玉米25粒。培养皿倾斜，防止培养皿中的水没过种子，置于培养箱中进行发芽。每个处理设置4次重复。环境条件为光照强度为10 000 lx，光/暗培养分别为12 h/12 h，温度25℃/20℃昼夜交替，相对湿度为85%。每日观察记录种子发芽情况，一周后将萌发的幼苗取出进行发芽指标的测量。

种子在室温条件下于培养皿(底部铺设滤纸)保湿催芽24 h，露白后播种于花盆(15 cm × 15 cm)中。每盆装土4 kg(中性黄壤)，播种5粒。待植物生长至一叶期、三叶期、五叶期，分别开始进行淹水处理。淹水时，将花盆至于装水培养盘(30 cm高)中，保持水面高于土壤表面2 cm，每日补水两次。对照组土壤保持田间持水量的75%。于每日的上午7点和下午7点进行补水。每处理设置3次重复。待连续淹水10 d后，测株高。

1.3 测定内容与方法

1.3.1发芽指标测定 每天记录发芽(胚根达种子长度、胚芽鞘达1/2种子长度)种子数，并在种子萌发第7 d，计算发芽率(发芽种子数占总种子数的百分比)；以发芽第3 d的发芽率作为发芽势。在种子萌发第7 d，随机选取10株幼苗，用千分尺测量其胚根长度和胚芽长度，幼苗于105℃杀青20 min,并在70℃条件下烘干至恒重。

1.3.2形态指标 盆栽试验在淹水10 d后，用卷尺测量株高，每盆测量5株，求取平均值。将各盆植株整株取出后用自来水冲洗干净，然后放入烘箱中，105℃杀青后，于70℃烘干至恒重(约48 h)。

1.3.3理化指标测定 淹水10 d后，采集植株完全展开的第2片叶(从植株顶端由上往下)进行理化指标的测定。游离脯氨酸含量采用酸性茚三酮法[15]测定，丙二醛(MDA)含量(以鲜质量计)采用硫代巴比妥酸法(TBA)测定[16]；超氧化物歧化酶(SOD)活性(以鲜质量计)参照Rawat等[17]的方法测定；过氧化物酶(POD)活性采用木酚法测定[18]；过氧化氢酶(CAT)活性采用过氧化氢法测定[19]；抗坏血酸过氧化物酶(APX)活性测定参考Amorati[20]的方法。

1.4 数据处理

使用Microsoft Excel 2010整理数据、GraphPad Prism 9作图，采用SPSS 23.0 进行方差分析，Duncan方法检验各处理水平在P<0.05水平的差异性。

2 结果与分析

2.1 EBR引发对种子萌发特性的影响

2,4-表油菜素内酯(EBR)引发种子显著影响了甜高粱和青贮玉米的种子萌发性能(表1)。随着EBR浓度从0.001 μmol·L-1增加到0.01 μmol·L-1，两个品种胚根和胚芽长度显著增加(P<0.05)，但之后随着EBR浓度的上升，胚根、胚芽长度呈下降趋势。当EBR浓度达到10 μmol·L-1时，除甜高粱胚根长度与对照无显著差异外，两个品种的胚芽长及玉米胚根长仍大于对照(P<0.05)。引发对胚根干重整体无显著影响，而EBR浓度1 μmol·L-1时，甜高粱胚根干重显著低于其它处理(P<0.05)，而玉米胚根干重显著高于其它处理(P<0.05)。胚芽干重在低浓度EBR(0.01和0.1 μmol·L-1)时显著高于对照及其它处理(P<0.05)。引发对种子发芽率无显著影响，提高了种子发芽势，且EBR浓度为0.01 μmol·L-1时玉米的发芽势均显著高于其它处理(P<0.05)。相较于EBR引发，水引发也能促进种子萌发，但其整体效果不如0.01 μmol·L-1EBR。

表1 2,4-表油菜素内酯引发对甜高粱和玉米种子萌发特性的影响

2.2 水涝胁迫下种子引发对甜高粱与玉米生长发育的影响

甜高粱和玉米的株高、干重均受淹水处理、种子引发、发育时期及它们交互作用的显著影响(表2)。淹水后，两种作物在三个时期均表现为株高和干重显著下降(图1)。在未引发对照中，一叶期、三叶期和五叶期，甜高粱淹水后的株高较未淹水处理分别下降24.39%，35.16%和19.21%，干重下降14.96%，5.94%和16.91%；玉米株高下降27.35%，18.24%和13.95%，干重下降47.47%，53.33%和32.33%。EBR引发种子后，两种作物均表现为株高及干重显著上升(P<0.05)，且EBR引发效果显著好于水。整体上，EBR引发种子后，两种作物在一叶期和三叶期均表现为水涝条件下株高和干重增加幅度高于正常水分条件下株高和干重的增加幅度。对于甜高粱而言，与未引发对照比较，一叶期、三叶期和五叶期，正常水分条件下EBR引发使甜高粱株高分别增加18.29%，20.31%和13.91%，而水淹条件下分别增加29.03%，27.71%和13.93%。对于玉米而言，一叶期、三叶期和五叶期，正常水分条件下EBR引发使甜高粱株高分别增加25.64，29.05%和16.89%，而水淹条件下分别增加32.94%，41.32%和16.89%。

图1 种子引发对淹水胁迫下甜高粱(A,B)和青贮玉米(C,D)株高和干重的影响

表2 种子引发影响水涝胁迫下甜高粱和玉米理化指标的方差分析(F值)

2.3 水涝胁迫下种子引发对甜高粱和玉米中脯氨酸和丙二醛含量的影响

淹水后，甜高粱和玉米叶中的脯氨酸含量和丙二醛含量均上升(图2)。而EBR引发种子后，叶片中游离脯氨酸含量较未引发对照增加幅度呈上升趋势。如在淹水条件下，玉米一叶期、三叶期和五叶期未引发对照较正常水分条件分别增加52.43%，11.53%和42.71%，而EBR引发处理分别增加94.98%，95.78%和101.45%；甜高粱未引发对照分别增加63.99%，29.08%和18.30%，而EBR引发分别增加84.38%，66.33%和80.69%。

图2 引发对淹水胁迫下甜高粱(A,B)和玉米(C,D)苗期脯氨酸和丙二醛含量的影响

与未引发对照比较，引发处理降低了淹水条件下甜高粱和玉米叶中的MDA含量。如玉米中，一叶期、三叶期和五叶期未引发对照MDA含量淹水后分别增加201.55%，288.67%和323.93%，而EBR引发处理后分别增加143.87%，184.26%和159.00%。在甜高粱中，一叶期、三叶期和五叶期未引发对照MDA含量淹水后分别增加294.25%，197.82%和372.51%，而EBR引发后分别增加93.92%，107.27%和150.85%。

水引发处理与未引发对照相比也提高了淹水胁迫下植株体内的脯氨酸含量，降低了MDA含量的增加幅度，但其效果整体低于EBR引发处理。

2.4 水涝胁迫下种子引发对甜高粱和玉米抗氧化酶活性的影响

淹水后，不同时期玉米和甜高粱叶片中的SOD，POD，APX，CAT活性均呈上升趋势(图3)。与未引发相比，EBR引发相对增加了淹水胁迫下植物体内各氧化酶活性，而在正常水分条件下叶片抗氧化酶活性整体无显著变化。对甜高粱而言，水涝胁迫条件下EBR引发植株各氧化酶活性的增幅整体上大于水引发植株各氧化酶活性的增幅。对玉米而言，在水涝胁迫下EBR引发植株的SOD，CAT酶活性显著高于水引发植株，APX活性在水引发和EBR引发间无显著差异，五叶期EBR引发植株POD活性显著高于水引发处理。

图3 种子引发对淹水胁迫下甜高粱(A，B，C，D)和青贮玉米(E，F，G，H)抗氧化酶活性的影响

3 讨论

种子引发是一种低成本、有效的生理生化过程，能刺激种子萌发，改善植物在非生物胁迫下的生长发育[21]。本试验中，EBR引发种子后，胚芽、胚根长度显著提高，说明引发时EBR透过种皮，进入种子，继而影响了种子的早期萌发。但EBR的引发效果与引发浓度直接相关，当EBR浓度为0.01 μmol·L-1时，甜高粱和玉米的胚芽和胚根长均显著高于其它浓度水平，且在高浓度时(10 μmol·L-1)最低。于此同时，EBR浓度为0.01 μmol·L-1时，胚根干重与对照无显著差异，甜高粱胚芽干重仍然是所有浓度处理中最高的。说明引发在促进胚根伸长的同时，使胚根变细。本试验中，EBR引发未显著增加两个品种的种子发芽率，但0.01 μmol·L-1的EBR使种子发芽势显著提高。这与多数研究研究一致，即引发对发芽率的改善效果低于发芽势[22]。发芽势提高有利于田间整齐发芽，便于苗期田间管理，提高生产力[23]。整体而言，0.01 μmol·L-1的EBR引发种子，对甜高粱和青贮玉米的发芽势及胚芽、胚根长发育有较为显著的影响。

当植物遭受水涝胁迫时，缺氧环境将影响根系的有氧呼吸与养分吸收[24]，最终影响生长发育。本试验中，两种作物在三个时期均表现为株高和干重显著下降，其中甜高粱干重下降幅度(平均26.25%)小于玉米干重下降幅度(43.82%)。说明淹水胁迫对两种作物的影响不同，其中玉米较甜高粱对淹水敏感。在坝地玉米、甜高粱耐淹试验中，在同等淹水条件下，玉米受害程度较重，甜高粱受害程度较轻，即甜高粱的耐淹性能优于玉米[25]。这与本试验在苗期的研究结果一致。因此，在作物生长期存在淹水风险的地区，可优先考虑种植甜高粱。

EBR引发种子后，两种作物在一叶期和三叶期均表现为水涝条件下株高和干重增加幅度高于正常水分条件。这说明引发提高了两种作物对淹水胁迫的适应能力。种子经EBR引发后，苗期进行水涝处理时植株体内相关的抗氧化酶(POD，SOD，APX，CAT)活性较未引发处理显著增加。这种变化将清除体内因无氧呼吸产生的大量自由基[26]，使MDA的含量下降，减轻淹水胁迫对植物细胞膜的损害。同时，本试验中，EBR引发后植株体内游离脯氨酸含量上升，说明引发处理通过增加脯氨酸积累提高细胞的渗透压。耐缺氧品种‘绿巴春4号’和缺氧敏感品种‘中农8号’的幼苗在添加或不添加EBR的常氧或缺氧营养液中水培8 d，EBR处理显著提高了缺氧胁迫下的幼苗生长和SOD，APX等抗氧化酶的含量[27]，这和本试验的研究结果一致。因此，EBR引发甜高粱和玉米种子，可在苗期淹水胁迫时，提高抗氧化酶活性，降低膜脂过氧化，同时合成较多的渗透调节物质(脯氨酸)，以维持稳定的细胞渗透压。EBR种子引发的甜高粱与青贮玉米比较，淹水胁迫后，甜高粱MDA含量增加幅度(三个时期分别为66%，120%和93%)低于青贮玉米(分别为143%，147%和140%)，脯氨酸含量增加幅度也表现出相似趋势，说明EBR种子引发的甜高粱在淹水后受到的胁迫较玉米轻。这与青贮玉米淹水胁迫后干重下降幅度较甜高粱大的结果一致。

4 结论

0.01 μmol·L-1的EBR引发种子可提高甜高粱与青贮玉米的发芽势，增加淹水胁迫下植株体内的抗氧化酶活性，降低膜脂过氧化水平，同时合成较多的渗透调节物质如脯氨酸，适应淹水胁迫，最终提高株高和干重。EBR种子引发后，甜高粱在淹水胁迫后积累的丙二醛和脯氨酸少于青贮玉米，干重下降幅度也低于青贮玉米，说明甜高粱苗期耐涝性强于青贮玉米。在生产中，建议选用0.01 μmol·L-1的EBR引发甜高粱和青贮玉米种子，提高植物的耐涝性。