低温和干旱胁迫下牧草的抗逆性机制

韩福松, 余成群, 付 刚*, 彭 依

(1.中国科学院地理科学与资源研究所，拉萨农业生态实验站，北京 100101；2.湘潭市雨湖区鹤岭镇烧汤河学校，湖南 湘潭 411100)

低温和干旱是抑制牧草生长、降低牧草产量和品质的两个非生物胁迫因子。三基点温度(最低温度、最适温度和最高温度)是牧草生长发育最基本的温度指标，当环境温度低于牧草生长发育所需的最低温度阈值时，牧草种子萌发、幼苗生长和营养物质分配等都会受到不同程度的影响，从而造成牧草产量下降、甚至造成牧草死亡[1-2]。干旱尤其是极端干旱则是制约牧草规模化建植和科学高效生产等的另外一个非常重要的非生物胁迫因子[3-4]。牧草生长发育过程中，干旱尤其是极端干旱的气候条件会造成牧草严重减产甚至死亡[3-9]。近年来由于气温逐渐变暖、水资源缺乏越来越严重等因素，各地旱情频繁发生，牧草的生长发育受到干旱限制的现象也越来越普遍[10]。因此，探讨低温和干旱对牧草生长及其产量等的影响规律及其调控机制，对寻找提高牧草的抗逆性、保障牧草高产和稳产等有效措施都具有非常重要的理论意义和实践价值。目前，有关低温和干旱胁迫下牧草抗逆性机制方面的研究已取得了一系列进展，在此本文对其进行了综述。

1 低温和干旱胁迫对牧草形态结构的影响

牧草形成的抗逆性形态结构能够直观地反映牧草受胁迫的程度，综合评价牧草的抗寒性和抗旱性需要深入研究低温和干旱胁迫下牧草形态结构的响应规律。因此，在牧草形态结构应对低温和干旱胁迫方面已经开展了大量研究，并在牧草抗寒性和抗旱性的形态结构指标的鉴定和筛选、以及低温和干旱胁迫对牧草形态结构的一般性影响规律等方面取得了一系列研究成果[11-14]，这些研究成果能够为牧草抗逆性机制研究等提供相对直观的具有重要参考价值的理论和实践指导。

低温和干旱胁迫条件下牧草会形成多种抗逆性形态结构，这些形态结构的变化能很好地体现环境胁迫对牧草的影响或牧草对逆境的适应能力[15-17]：(1)作为牧草生长发育的最初始阶段，牧草种子萌发期往往是其最脆弱的一个生长发育阶段，牧草种子萌发期对低温和干旱胁迫等逆境条件非常敏感[7,18]。牧草种子萌发期的抗寒和抗旱能力水平直接影响着牧草的出苗、幼苗生长和草地建植等[19-21]。因此，鉴定和评价牧草种子萌发期的抗寒和抗旱能力水平具有重要的现实意义。牧草种子发芽率、胚根长和胚芽长等指标是反映种子萌发特征的重要形态结构指标[22-23]。(2)牧草叶片不仅在植物光合作用和蒸腾作用等方面发挥着极其重要的作用，而且是低温和干旱等逆境胁迫条件下牧草最敏感的器官之一[24-26]。一般而言，牧草叶片角质层不仅能够有效地减少牧草体内水分的散失，缓解水分供应不足时牧草的萎蔫程度，而且其具有的折光性还可以避免过强的日照对牧草造成伤害；牧草叶片越厚，越可以防止水分的过分蒸腾；牧草叶片气孔密度越大、气孔数量越多，越利于牧草蒸腾散热、被动吸水和光合作用气体交换等；牧草叶片表皮毛可以通过反射强光的方式避免牧草叶片灼伤；牧草叶面积、叶片的栅栏组织、海绵组织及其比值，叶肉组织结构紧密度、上表皮和下表皮细胞密度等也是重要的抗寒性和抗旱性形态结构指标[4,8,17,27-30]。(3)牧草茎是其运输补给水分和营养成分的重要器官[31]。牧草茎的皮层是茎中表皮与维管束之间的薄壁组织，抗旱性强的牧草茎的皮层内往往含贮水细胞，这些贮水细胞可以调节牧草的保水能力，因此牧草茎的皮层厚度是牧草抗逆性的重要形态指标[28]。牧草茎的维管束一般由韧皮部和木质部组成，维管束中的导管直径大小影响着茎输送水分的有效性和抗旱能力[28,31]。(4)作为牧草吸水器官的根系不仅是最先感应干旱等逆境胁迫从而做出相应反应措施的器官，而且牧草根系形态结构与牧草生理功能关系密切。根系的木质化程度和输导组织等都会影响牧草的抗逆性，因此，牧草根的形态结构也是牧草抗逆性的重要形态结构[15,32]。牧草根系的木质层导管大小和导管密度等直接影响牧草根系的吸水能力[31]。

目前，有关牧草对低温和干旱胁迫的响应方面已经取得了一些一般性规律：(1)低温和干旱胁迫一般会抑制牧草种子萌发、幼苗生长、株高、叶面积、叶片舒展和根长等[9,11,22,33]。(2)不同种类的牧草形态结构对低温和干旱胁迫的响应不同[7,30]。如干旱胁迫下苜蓿(MedicagoSativa)种子的相对发芽率/相对发芽指数都大于扁蓿豆(Medicagoruthenica)[20]；低温胁迫下，扁穗冰草(Agropyroncristatum)的萌发率低于草原看麦娘(Alopecuruspratensis)[34]。(3)不同形态结构指标对低温和干旱胁迫的响应规律不同[7,11,13,24]。因此，通过单一的牧草生长发育的形态指标探讨牧草对低温和干旱胁迫的响应很可能并不能科学准确地反映牧草的抗逆性综合能力大小[7,12]。为了更好地鉴定牧草的抗寒性和抗旱性，需要采用隶属函数等方法将多个牧草生长发育形态指标整合为一个综合形态指标以探讨牧草形态结构对低温和干旱胁迫的响应规律[6,20]。(4)低温和干旱胁迫对牧草形态结构的影响会随着胁迫时间的推移而发生变化[35]。如延长干旱胁迫的时间，会降低扁蓿豆叶片气孔开放率[17]。(5)低温和干旱胁迫对牧草形态结构的影响会随着胁迫程度的加剧而变化[36-37]。如扁蓿豆的叶片气孔密度随干旱程度增加呈倒U字形曲线[17]。干旱胁迫幅度降低可能利于牧草种子萌发，这与低幅度的干旱可能通过启动牧草种子内部的一些保护机制的方式降低牧草种子吸胀过程中的膜系统损伤以及增强膜系统的恢复能力有关[11]。(6)随着牧草生长其耐低温和抗旱能力可能会逐渐增强[6-8,13,20,38]。因此，只鉴定分析牧草某一特定时期(如种子萌发期)的形态特征的抗寒性和抗旱性并不能完全反映牧草形态结构的抗逆性，需要从牧草种子萌发期、幼苗期甚至全生育期进行综合评价[11-13]。

2 低温和干旱胁迫下牧草抗逆性生理机制

牧草抗逆性生理机制是牧草响应和适应低温和干旱等胁迫的重要机制之一，综合评价牧草的抗寒性和抗旱性需要深入研究低温和干旱胁迫下牧草的生理生化特征的响应规律[39-43]。因此，围绕低温和干旱对牧草的生理生化指标的影响规律已经开展了一系列研究，并在牧草抗寒性和抗旱性的生理生化指标的鉴定和筛选、以及牧草抗寒性和抗旱性生理生化机制等方面取得了丰富的研究成果[11,44-46]。

通常当牧草未遇到环境胁迫时，牧草细胞活性氧自由基及其清除机制处于动态平衡中。低温或干旱等胁迫会引起牧草细胞内活性氧自由基的快速积累，从而打破牧草细胞内原有的活性氧自由基的产生和清除的动态平衡状态，进而危害牧草蛋白质、质膜透性以及其它细胞成分甚至造成细胞死亡等[39,56,65]。(1)低温等逆境下种子失去萌发能力的一个很重要的原因可能是环境胁迫抑制了牧草种子细胞中相应酶的活化，从而抑制了种子内部一系列的生理生化反应[66-67]。(2)低温和干旱等胁迫主要通过气孔限制和非气孔限制影响光合作用[44,59]。低温和干旱等逆境一方面可以通过破坏叶绿素的片层结构抑制叶绿素的合成，另一方面通过加快对已经合成叶绿素的分解影响光合作用[8,17]。(3)牧草处于低温或干旱胁迫条件下时，牧草可以通过调控光合产物在根、茎和叶中的再分配方式提高其抗寒性和抗旱性[17,30,44,68]。(4)不同物种的牧草的生理生化特征对低温和干旱胁迫的响应不同[61,65,69-71]，这可能与它们的生存环境、遗传特性以及在低温和干旱胁迫下的抗性形成的生理生化机制不同有关[8,66,71]。(5)不同的牧草生理生化指标对低温和干旱胁迫的响应规律不一致[6,65]。扁蓿豆叶片游离脯氨酸对干旱表现出的变化趋势与可溶性蛋白并不相同，这可能与它们所起的作用和调节机制不同有关[72]。这说明单一的牧草生理生化指标并不能全面解释牧草抗寒性和抗旱性形成的生理生化机制，需要结合多个生理生化指标综合反映牧草的抗逆性形成的生理生化机制[14,65,70,73]。(6)牧草生理生化指标会随着胁迫时间的延长而发生变化，牧草叶绿素等的不可逆破坏需要经历长期的低温和干旱胁迫[8,17,49,61,65]。如干旱胁迫时间与扁蓿豆幼苗叶片相对含水量呈负相关关系[72]。(7)不同程度的低温和干旱胁迫对牧草生理生化指标的影响规律不同[6,8,65,70,74]。如增加扁蓿豆幼苗的低温胁迫程度，其叶片内超氧化物歧化酶和过氧化物酶活性表现为先升后降[56]。随着干旱胁迫程度的增加，白草(PennisetumflaccidumGrisebach)的脯氨酸和叶绿素含量总体呈先升后降趋势[75]。

3 低温和干旱胁迫下牧草抗逆性分子机制

从分子生物学角度探讨牧草对逆境胁迫的应答机制是草业科学家们探索的关键科学问题[2,76]。低温和干旱胁迫下，牧草抗逆性分子机制是牧草低温和干旱胁迫下重要的内在调控和适应机制，综合评价牧草的抗寒性和抗旱性需要深入研究低温和干旱胁迫下牧草抗逆性分子机制[77-78]。随着科学技术的进步，组学(包括转录组学、蛋白质组学和代谢组学等)已经成为研究牧草抗逆性分子机制的重要手段，从基因组到代谢组，是从上游到下游的一个调控过程，越靠近下游检测的结果越接近逆境环境下的牧草表型[79-80]。低温和干旱胁迫下牧草抗性基因、关键蛋白和酶类的鉴定和筛选等与牧草抗逆性分子机制相关的研究已经取得了一系列研究成果，如拟南芥(Arabidopsisthaliana)和蒺藜苜蓿(Medicagotruncatula)等模式植物的基因组测序工作已经完成[47,81-82]。已有研究成果不仅能够为未来鉴定和分析适应不利胁迫环境的候选基因提供有价值的基因资源，而且对牧草的遗传改良等具有重要的实践价值[82-84]。然而牧草应答逆境胁迫的机制是复杂多样的。当牧草处于逆境环境时，牧草会在基因表达、信号转导和代谢产物形成等多个层次响应，然而单一的组学研究在解释牧草抗逆性分子机制方面的能力有限[80]。因此，今后需要加强多组学联合分析，从多领域和多层面探讨牧草的抗逆性分子机制，对从整体上认知牧草逆境胁迫的应答机制以及为提高牧草的抗逆性提供理论依据。

为了抵御和适应低温和干旱等逆境环境条件，牧草形成了涉及多基因和多信号途径的应答反应机制[64,79,84-85]。在分子水平上，牧草的抗寒和抗旱能力表现为牧草对低温和干旱胁迫产生迅速应答、低温和干旱信号在牧草体内的转导、应答和抵御基因的表达的综合作用[47,86]。逆境胁迫下信号传导过程一般可以分为信号感知、信号转导、转录调控、响应基因的表达以及生理生化和形态结构反应的激活等[84,86]。上游低温和干旱胁迫信号的感知及其转导等是开启/关闭转录调控的诱导因子[63-64]。Ca2+、脱落酸和促分裂原活化蛋白激酶级联信号通路等是调控转录因子的重要信号途径[47,84-87]。具体表现如下：(1)低温和干旱胁迫会促使牧草细胞内Ca2+的迅速增加，从而开启Ca2+依赖的胁迫响应信号通路，进而调节相关基因的表达[83-84,88]。(2)脱落酸在干旱等胁迫的诱导下在细胞中积累，并与脱落酸受体PYR/PYL/RCAR结合形成ABA-PYR/PYL/RCAR复合体，该复合体可以降低蛋白磷酸酶2C的活性并释放蔗糖非酵解蛋白激酶2，从而通过磷酸化对应的转录因子调节下游的脱落酸功能基因的表达，并最终引起气孔关闭[84]。(3)干旱胁迫抑制了干草根细胞壁中天冬酰胺酰内肽酶等的基因表达，而促进了干草根中乙烯、细胞分裂素和脱落酸等的生物合成和信号转导，从而提高了干草适应干旱胁迫的能力[89]。(4)随着干旱胁迫时间的推移，响应干旱胁迫的ABC转运蛋白的种类及其响应幅度都不同[90]。

3.1 表观遗传学

越来越多的研究从表观遗传学角度探讨了低温和干旱胁迫等逆境下牧草抗逆性分子机制，表观遗传学是以DNA甲基化和组蛋白修饰为主的染色质修饰影响基因的转录功能，同时非编码RNA修饰和RNA甲基化影响mRNA翻译为蛋白质的能力，进而促使植物表型产生变化。在低温和干旱等胁迫下，牧草通过改变甲基化程度影响DNA甲基化状态、染色质结构和相关基因的表达，进而调控牧草对逆境胁迫的响应[91]。与空白对照组相比，扁蓿豆在低温或干旱胁迫处理下的MrMET1和MrDRM2基因表达量发生了变化，且随着低温或干旱胁迫累计时间的延长而发生变化[91]。干旱胁迫幅度越大，老芒麦(Elymussibiricu)基因组DNA甲基化水平越高[92]，多年生黑麦草(Loliumperenne)甲基化水平则下降[93]。低温胁迫会提高紫花苜蓿基因组DNA甲基化水平[94]。Ding等[95]研究发现三胸蛋白调控着干旱胁迫下拟南芥的响应。

3.2 转录组测序技术

伴随着转录组测序技术(RNA-Seq)等相关技术的诞生和发展，目前已经从牧草中筛选出大量的参与低温和干旱胁迫应答的基因[47,64,76,81,87-88,91,96-98]，这些基因一般可以分为功能基因和调节基因两类[84]。逆境胁迫应答功能基因通过编码各种重要的酶和代谢蛋白(如水通道和离子转运蛋白等)直接保护细胞免受逆境胁迫的伤害[84]。逆境胁迫应答调节基因通过编码各种调节蛋白(包括转录因子、蛋白激酶和蛋白磷酸酶)调节逆境胁迫反应中的信号转导和基因表达[83-84]。其中蛋白激酶通过逐级磷酸化激活下游的转录因子，从而启动相关基因的表达。当处于低温和干旱胁迫条件下，牧草会通过一系列信号途径激活转录因子，被激活的转录因子通过调控一系列相关抗逆功能基因或其他转录因子的表达，从而提高牧草的抗寒性和抗旱性[64]。转录因子还可以通过调节各种生化代谢途径调控植物对低温和干旱胁迫的响应[84]。虽然单个转录因子可以调控(激活、抑制)大量下游靶基因的转录，但是单一的靶基因又受到不同的转录因子的调控，因此，在植物逆境胁迫调控网络中，转录因子间的串扰现象普遍存在[83-84]。典型的转录因子一般由DNA结合域(DNA-bindingdomain)、转录调控域(transcription-regulation domain)、寡聚化位点(oligomerization site)和核定位信号区(nuclear localization signal)等功能域组成[85]。转录因子可分为AP2/ERF,bHLH,MYB和WRKY等家族[84-85]。如(1)作为植物特有的转录因子家族之一，AP2/ERF转录因子通过依赖或不依赖于激素信号途径在牧草响应低温和干旱胁迫过程中发挥重要作用[63-64]。AP2/ERF转录因子包括DREB和ERF等5个亚家族[63,85]。(2)bHLH转录因子通常与E-Box顺式作用元件组合，进而调控下游基因的表达[83,99]。(3)MYB是调控植物对环境胁迫的重要成员[100-101]。作为一个含有约52个氨基酸的区域，MYB结构域可以形成螺旋-环-螺旋构象，进而与特定的DNA结合[102]。虽然植物中的MYB转录因子一般可能含有1至4个MYB DNA结合结构域，然而最常见的是R2R3类转录因子(其含有两个MYB DNA结合结构域)[102-103]。作为R2R3-MYB家族的转录因子成员，MYB15能够与MYB识别的CBFs启动子区域结合，从而抑制CBFs的表达，降低植物的抗寒性[47,83]。(4)WRKY转录因子具有特殊的七肽保守序列WRKYGOK[104]。根据结构域数量和锌指结构特征，WRKY转录因子可划分为三类：第一类含2个WRKY结构域；第二类含有1个WRKY结构域且锌指结构为C2H2型；而第三类含1个WRKY结构域且锌指结构为C2HC型[83]。WRKY转录因子主要通过特异性与启动子区域的W-box结合，从而调控靶标基因的表达、参与植物响应低温和干旱胁迫的信号通路，并可以与多种蛋白发生相互作用从而实现WRKY转录因子在低温和干旱信号转导途径中的功能[83,104]。任永娟等[104]指出WRKY转录因子主要是通过调控非生物胁迫响应相关基因、抗逆信号通路基因和自身基因的表达，调控ABA等信号途径，与其他蛋白互作以及参与植物生理过程实现调控植物对非生物的胁迫。(5)干旱胁迫对大多数NAC转录因子都有影响[84]。许多NAC转录因子都是干旱胁迫条件下脱落酸信号通路中的重要参与者。

3.3 蛋白质组学

蛋白质组学(Proteomics)是系统研究各种不同时空、环境条件下由生物体基因组、细胞或组织表达的所有蛋白质的组成、结构和功能等的学科[82]。低温和干旱胁迫都会引起牧草体内的生理生化和基因表达等方面的系列变化，从而造成蛋白质水平的差异表达，即牧草的大量蛋白质特异性表达以应对低温和干旱胁迫过程[105]。牧草体内的光合作用相关蛋白、脱水蛋白和营养贮藏蛋白等的积累在调节低温胁迫下牧草的响应方面具有关键作用[82,106]。分子伴侣蛋白和热休克蛋白(HSP60，HSP70和HSP90)都参与维持蛋白质分子的稳定性[107-109]，组织蛋白酶B、半胱氨酸蛋白酶、脂质转移蛋白和水通道蛋白都参与水解和跨膜运输，谷胱甘肽磷脂氢过氧化物酶、过氧化物酶、脱氢抗坏血酸还原酶和单脱氢抗坏血酸还原酶的活性都参与活性氧清除[107-108,110]，这些蛋白都是响应干旱胁迫的重要蛋白。如干旱胁迫通过降低苜蓿RuBisCO含量以及限制固氮酶的激活与再生的方式对苜蓿光合作用产生抑制作用[111]。

3.4 代谢组学

代谢组学(Metabolomics或Metabonomics)是定性和定量分析生物或细胞全部低分子量代谢产物的合成、分解和转化规律等的学科，是系统生物学的重要组成部分，在揭示植物生命活动规律方面发挥着越来越重要的作用[80]。牧草代谢产物作为牧草基因转录与蛋白修饰的最终产物，更接近牧草的表型，对其进行研究可以揭示低温和干旱等胁迫条件下牧草的抗逆性分子机制[79-80,112]。代谢组主要可以分为靶向代谢组学和非靶向代谢组学[112]。靶向代谢组虽然可以针对单个或少量目标代谢产物进行检测，但是可检测的通量相对较低。非靶向代谢组可以在对整个代谢组进行系统和全面分析的基础上获取大量代谢产物数据，从而找出差异表达代谢产物的一种方法。牧草可以通过不同代谢途径减少逆境影响，包括代谢靶标、氨基酸代谢以及碳水化合物类(糖类)代谢等[113]。其中碳水化合物(糖类)作为牧草生命活动的基础物质，是牧草抗逆代谢的基础。氨基酸不仅可以协助牧草响应逆境胁迫，而且是很多重要代谢产物的合成源[113]。

3.5 基因组学

基因组学(Genomics)是通过高通量测序技术(如宏基因测序等)对牧草进行全部/部分基因组测序等的学科，已历经一代、二代和三代测序。紫花苜蓿、蒺藜苜蓿等牧草基因组的破译(尤其是抗旱、抗寒基因的破译)[47,81-82]对于牧草抗旱/抗寒的分子机制的进一步深入研究、抗旱/抗寒转基因牧草的研发等都具有极其重要的指导意义。随着科学技术的高速高质量发展，未来通过基因组学技术，可以大大提高牧草抗逆性。如高璇等发现橡胶草(Taraxacumkok-saghyz)的TkAPX3基因很可能是低温和干旱胁迫下的抗逆性基因[114]。舒必超等发现了低温胁迫下狗牙根(Cynodondactylon)的耐旱基因(CBF1,COR,LEA)[97]。

4 问题与展望

寒旱区是我国重要的牧业基地，这些区域牧草生长长期面临低温和干旱的双重胁迫。尽管当前针对牧草抗寒、抗旱机制的研究成果较为丰富，但是各个研究相对独立，且寒旱区牧草对全球变化的响应与适应的相关研究相对较少。因此，未来应加强以下三个方面的研究：(1)加强牧草形态、生理生化和分子生物学的系统性综合抗逆性研究；(2)结合全球气候变化特征，研究寒旱区牧草对全球气候变化的响应、适应和反馈机制；(3)优选主栽牧草，开展全球变化背景下主栽牧草的系统性抗逆性试验研究。这些研究将有利于更加全面认识牧草抗逆性机制长期动态变化规律，从而为筛选适宜寒旱区的优良牧草品种提供科技保障，并最终为我国寒旱区草牧业的高质量发展提供科技支撑。