腹膜透析患者血清lncRNA MEG3、miR-223水平与腹主动脉钙化的相关性分析

李涛，谢赛，虞典元，江志锋，李丹

腹膜透析可治疗终末期肾脏病，但其治疗过程中会出现血管钙化等并发症[1-2]。血管钙化会增加血管脆性及心血管疾病的发病率[3]。因此如何有效预防腹膜透析患者腹主动脉钙化(abdominal aortic calcification，AAC)是临床医师需关注的重点。长链非编码RNA MEG3(long non-coding RNA MEG3，lncRNA MEG3)在癌症中较为常见，可通过调节微小RNA-1930-5p(microRNA-1930-5p，miR-1930-5p)/混合系白血病Trithorax家族1(mixed lineage leukemia Trithorax 1，Mllt1)轴，导致脑出血后脑微血管内皮细胞功能障碍[4-5]。微小RNA-223(microRNA-223，miR-223)是一种与炎性反应密切相关的miRNA，可通过调节血管平滑肌细胞轴导致严重的冠状动脉病变[6]。然而lncRNA MEG3、miR-223与血管钙化的相关性目前尚缺乏研究报道，因此，本文旨在探讨腹膜透析患者lncRNA MEG3、miR-223与AAC的相关性，报道如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取2020年9月—2021年9月武汉科技大学附属孝感医院肾脏内科收治的腹膜透析患者100例为研究对象，依据腹膜透析患者是否出现AAC分为AAC组52例(52.00%)和非AAC组48例(48.00%)。2组性别、体质量指数(BMI)、透析时间、收缩压(SBP)、舒张压(DBP)、高血压、疾病类型、肾病家族史、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、总胆固醇(TC)、三酰甘油(TG)、血红蛋白(Hb)、白蛋白(Alb)、血钙(Ca)比较，差异无统计学意义(P>0.05)。AAC组年龄、糖尿病比例、血磷(P)、腹主动脉钙化评分高于非AAC组(P<0.05)，25-羟维生素D3低于非AAC组(P<0.01)，见表1。本研究经医院伦理委员会批准(202008-05)，且患者及家属均知情同意并签署知情同意书。

1.2 病例选择标准 (1)纳入标准：①接受腹膜透析≥3个月者；②患者一般资料齐全；③1个月内未使用激素、免疫抑制剂及其他血液制品治疗者。(2)排除标准：①近期内有创伤史、手术史或急性感染史者；②有影响钙、磷代谢的相关疾病、恶性肿瘤及肝硬化者；③有精神障碍性疾病或行动不便，无法配合完成研究者。

1.3 观测指标与方法

1.3.1 临床资料收集及生化指标检测：收集患者性别、年龄、BMI、透析时间、收缩压、舒张压、高血压、糖尿病、腹主动脉钙化评分、疾病类型等一般资料。采用Cobas 6000型全自动生化分析仪(瑞士罗氏公司)检测Ca、P、HDL-C、LDL-C、TC、TG、Hb、Alb水平，采用酶联免疫吸附(ELISA)法检测25-羟维生素D3水平，按试剂盒(上海远慕生物科技有限公司)说明进行操作。

表1 非AAC组和AAC组临床资料及生化指标比较

1.3.2 血清lncRNA MEG3、miR-223水平检测：收集所有腹膜透析患者入组时清晨空腹肘静脉血5 ml，室温放置30 min，离心收集血清并置于-80℃冻存。RNA提取试剂盒(北京康瑞纳生物科技有限公司)提取总RNA后，按照反转录试剂盒(北京伊塔生物科技有限公司)说明书进行反转录合成cDNA，将得到的cDNA样品通过7500型实时荧光定量PCR仪(美国ABI公司)检测血清lncRNA MEG3、miR-223表达，其引物序列见表2。

表2 lncRNA MEG3、miR-223及内参GAPDH、U6引物序列

1.4 AAC评估及分组 所有腹膜透析患者接受腹部CT检查，根据腹主动脉走行区出现密度大于130 Hu的斑块为AAC[7]；腹主动脉钙化评分及分组：依据Kauppila等[8]的半定量评分系统进行评分，依次评价 L1～4 每个节段腹主动脉前壁、后壁钙化的严重程度，根据该节段钙化累及范围给予1分(范围 <1/3)、2分(范围 1/3～2/3)和3分(范围>2/3)，总得分为0～24分，当腹主动脉钙化评分>4分时定义为重度AAC，否则为轻度AAC。根据检查结果将AAC组患者分为重度AAC亚组21例和轻度AAC亚组31例。

2 结 果

2.1 非AAC组和AAC组血清lncRNA MEG3、miR-223水平比较 AAC组血清lncRNA MEG3高于非AAC组，血清miR-223低于非AAC组(P<0.01)，见表3。

表3 非AAC组和AAC组血清lncRNA MEG3、miR-223水平比较

2.2 重度AAC亚组和轻度AAC亚组血清lncRNA MEG3、miR-223水平比较 重度AAC亚组血清lncRNA MEG3高于轻度AAC亚组(P<0.01)，血清miR-223低于轻度AAC亚组(P<0.01)，见表4。

表4 轻度AAC组和重度AAC组血清lncRNA MEG3、miR-223水平比较

2.3 不同亚组AAC特点比较 重度AAC亚组腹主动脉钙化评分高于轻度AAC亚组[(11.30±1.75)分vs.(3.35±0.61)分](t=19.959，P<0.001)。

2.4 腹膜透析AAC患者血清lncRNA MEG3、miR-223与临床资料及生化指标的相关性 Pearson法分析结果显示，腹膜透析AAC患者血清lncRNA MEG3与miR-223呈负相关(r=-0.552，P<0.001)。Spearman法及Pearson法分析结果显示，腹膜透析AAC患者血清lncRNA MEG3与年龄、糖尿病、磷、腹主动脉钙化评分呈正相关，与25-羟维生素D3呈负相关(P<0.05)；血清miR-223与年龄、糖尿病、磷、腹主动脉钙化评分呈负相关，与25-羟维生素D3呈正相关(P<0.05)。见表5。

表5 腹膜透析AAC患者血清lncRNA MEG3、miR-223与一般资料及生化指标的相关性

2.5 血清lncRNA MEG3、miR-223水平预测腹膜透析患者发生AAC的价值 以腹膜透析患者是否发生AAC为状态变量，以血清lncRNA MEG3、miR-223及二者联合预测概率值为检验变量，绘制ROC曲线结果显示，血清lncRNA MEG3、miR-223及二者联合预测腹膜透析患者发生AAC的AUC分别为0.898、0.823、0.942，二者联合预测腹膜透析患者发生AAC的价值大于单项预测(Z/P=1.667/0.048、2.441/0.007)，见表6、图1。

图1 血清lncRNA MEG3、miR-223水平预测腹膜透析患者发生AAC的ROC曲线

表6 血清lncRNA MEG3、miR-223水平预测腹膜透析患者发生AAC的价值

2.6 Logistic回归分析腹膜透析患者发生AAC的影响因素 以腹膜透析患者是否发生AAC为因变量，以上述分析结果中有统计学意义的变量lncRNA MEG3、miR-223、年龄、糖尿病、磷、25-羟维生素D3为自变量进行Logistic回归分析，结果显示lncRNA MEG3高表达是影响腹膜透析患者发生AAC的独立危险因素(P<0.01)，miR-223高表达是影响腹膜透析患者发生AAC的保护因素(P<0.01)，见表7。

表7 Logistic回归分析腹膜透析患者发生AAC的影响因素

3 讨 论

既往研究显示，年龄、高血压、血脂水平、炎性反应、钙磷代谢紊乱等因素影响血管钙化[9-10]。血管内膜出现的钙化主要集中在大动脉，此血管钙化主要与动脉粥样硬化斑块形成及衰老有关[11]。CT检查是检出血管钙化的常用手段，不仅清晰度好、分辨率高，还能对血管钙化程度进行定量研究[12]。本研究通过CT检查结果发现，100例腹膜透析患者中，52例发生AAC，其发生率为52.00%，与文献报道的AAC发病率基本一致[8]。然而CT检查价格昂贵且会增加腹膜透析患者辐射暴露的风险，导致其临床应用受限。因此需进一步探索更为便捷、有效且廉价的生化指标。

miR-223可通过外泌体形式进入血管平滑肌细胞，进而抑制平滑肌细胞的异常增殖和迁移[13]。韩迎春等[14]研究显示，miR-223可降低炎性反应，敲除miR-223后将使血管炎性反应水平升高，同时促进动脉粥样硬化疾病进展。Zhang等[15]研究结果显示，细胞焦亡可导致内皮功能障碍，lncRNA MEG3可抑制miR-223功能，增强血管炎性细胞焦亡，进而导致内皮功能障碍，促进动脉粥样硬化进展。本研究结果提示，腹膜透析患者血清lncRNA MEG3升高、miR-223降低可能与AAC的发生有关，且相关性结果提示二者可能在ACC病情发展中发挥协同作用。陈珍珍等[16]研究表明，lncRNA MEG3既可以通过促进内皮细胞增殖来调节血管内皮损伤，同时也能通过增加炎性介质促进内皮细胞凋亡。结合既往研究及本研究结果推测，部分患者在长期腹膜透析的过程中体内炎性水平升高，病理状态造成lncRNA MEG3表达出现代偿性升高，lncRNA MEG3负向调控靶基因miR-223使其表达水平降低，进而抑制血管内皮细胞的增殖及迁移，阻止血管损伤修复，加速血管钙化。

此外，根据本研究相关性及多因素结果进一步推测lncRNA MEG3、miR-223虽与年龄、糖尿病等因素相关，但仍是独立于年龄、糖尿病等因素的2个AAC标志物，且与年龄、糖尿病等因素相比，lncRNA MEG3、miR-223与AAC发生的相关性更高。本研究ROC曲线结果进一步表明联合检测血清lncRNA MEG3、miR-223水平有助于预测腹膜透析患者发生AAC，当lncRNA MEG3临界值>1.18，miR-223临界值<0.84时，腹膜透析患者发生AAC的风险较高，可警示临床医师进一步明确诊断，采取相应措施。此外，血清lncRNA MEG3、miR-223在不同严重程度AAC患者中的表达差异性进一步表明两指标不仅能有效预测AAC的发生，而且lncRNA MEG3升高、miR-223降低可提示钙化程度增加，但其相关作用机制仍待基础研究进一步证实。

综上所述，腹膜透析患者中AAC的发生率为52.00%，发生AAC的腹膜透析患者血清lncRNA MEG3升高、miR-223降低。lncRNA MEG3、miR-223有望成为预测腹膜透析患者发生AAC的标志物，但本研究中的预测截断值仍需进一步优化。此外，受病例数限制，本研究中未能排除其他影响钙化的相关因素，今后将增加样本量，排除干扰因素的影响。

利益冲突：所有作者声明无利益冲突

作者贡献声明

李涛：设计研究方案，实施研究过程，论文撰写；谢赛：提出研究思路，分析试验数据，论文审核；虞典元、江志锋、李丹:实施研究过程，资料搜集整理，论文修改