蝴蝶兰组织培养再生体系的建立

张清凤 赵 洁 普 春 李啟菊 马梅见

（昭通市农业科学院，云南昭通 657000）

蝴蝶兰又称蝶兰，为热带多年生名贵花卉，花色品种多，形态美妙，花大色艳，花期持久，一般可达2～3个月，最长可达半年，在热带兰种中素有“兰花皇后”的美称[1-2]。蝴蝶兰是一种高档商品兰花，适于家庭摆设或装扮花篮等。

蝴蝶兰属于单茎性气生兰，过去一般依靠摘心发出叶芽进行繁殖，但该方法对植株损害很大，现在较少采用[2]。蝴蝶兰植株极少发育侧枝，比其他种类的兰花更难进行常规无性繁殖[3]。应用植物组织培养技术进行蝴蝶兰快速繁殖可以缩短繁育周期，获得大量成株，并且可以保持优良性状，维护种质资源，从大量的繁殖后代中获得一定数量的突变体[4]。目前，蝴蝶兰快繁途径主要有：利用各种外植体诱导类原球茎，进而诱导分生苗实现快繁[5-6]，不经愈伤组织直接诱导丛生芽[5，7]。

本文对蝴蝶兰组织培养过程中的一系列关键技术进行研究，以期筛选出蝴蝶兰组织培养的最优技术参数，建立蝴蝶兰离体培养再生体系。

1 材料与方法

1.1 试验材料

蝴蝶兰茎尖较难剥离，且易伤植株，因而本试验选用蝴蝶兰的叶片及根尖作为外植体来诱导原球茎。

1.2 试验方法

1.2.1 培养基筛选。为了筛选诱导原球茎较好的培养基，研究人员开展了培养基筛选试验。试验设9个处理，具体见表1。取蝴蝶兰幼嫩叶片进行原球茎诱导，培养温度为24℃，光照强度为1 000 lx，光照时长为12 h/d，培养时间为40 d。

表1 培养基设计 单位：（mg·L-1）

1.2.2 不同外植体对原球茎形成的影响。以H培养基为基本培养基，各选取叶片、根尖外植体60个，研究不同外植体对原球茎形成的影响。培养温度为24℃，光照强度为1 000 lx，光照时长为12 h/d，培养时间为40 d。

1.2.3 温度和光照条件对原球茎形成率的影响。以叶片作为外植体，设置不同温度和光照条件，研究温度和光照条件对原球茎形成率的影响。试验设6个处理，具体见表2。培养时间为40 d。

表2 温度和光照条件设计

1.2.4 活性炭与抗坏血酸对抑制褐变的作用。采用活性炭与抗坏血酸抑制褐变的产生，设6个处理，具体见表3。培养温度为24℃，光照强度为1 000lx，光照时长为12 h/d，培养时间为40 d。

表3 抑制褐变处理设计 单位：（g·L-1）

1.2.5 不同浓度6-BA对原球茎增殖的影响。在蝴蝶兰组织培养中，要达到快速繁殖的目的，必须加快原球茎增殖速度。在原球茎球体阶段进行增殖是最理想的方法。在原球茎形成以后，分别转移到添加1.0、2.0、3.0 mg/L 6-BA的培养基中进行增殖。培养温度为24℃，光照强度为1 000 lx，光照时长为12 h/d，培养时间为60 d。

1.2.6 6-BA、NAA对试管苗生成的影响。蝴蝶兰原球茎转化成试管苗所用的培养基是H培养基，分别添加不同浓度的6-BA和NAA，研究6-BA、NAA对试管苗生成的影响。试验设9个处理，具体见表4。培养温度为24℃，光照强度为2 000 lx，光照时长为12 h/d，培养时间为40 d。

表4 不同浓度6-BA、NAA设计 单位：（mg·L-1）

1.2.7 不同浓度NAA对蝴蝶兰生根的影响。采用H培养基，分别添加 0.1、0.5、1.0 mg/L NAA，研究其对蝴蝶兰生根的影响。培养温度为24℃，光照强度为2 000 lx，光照时长为12 h/d，培养时间为40 d。

2 结果与分析

2.1 培养基筛选

由表5可看出：处理H1诱导出的原球茎最多，形成球状体的外植体百分比最高，为46.7%；处理MS1次之，形成球状体的外植体百分比为36.7%；处理VW1排第三，形成球状体的外植体百分比为30.0%。

表5 不同培养基对蝴蝶兰叶片原球茎状球体形成率的影响

2.2 不同外植体对原球茎形成的影响

如表6所示，叶片的原球茎形成率为56.67%，根尖的原球茎形成率为7.50%，说明用叶片作外植体诱导原球茎的效果好于根尖。

表6 不同外植体对原球茎形成的影响

2.3 温度和光照条件对原球茎形成率的影响

如表7所示，处理B2为最优处理，即在温度为24℃、光照强度1 000 lx、光照时长12 h/d的培养条件下，外植体易诱导形成原球茎球状体，原球茎形成率达到了46.7%。

表7 温度和光照条件对蝴蝶兰原球茎形成率的影响

2.4 活性炭与抗坏血酸抑制褐变效果比较

蝴蝶兰外植体接种后容易褐变，培养体褐变后基本上就死亡了。因此，抑制褐变产生也是培养成功的关键。如表8所示，活性炭和抗坏血酸对抑制褐变产生都有一定的作用。处理T1、T2、T3抑制效果较好，产生褐变外植体的百分比为20%～30%，远低于处理S1、S2、S3，且处理 T1、T2、T3组培苗长势也比较好。

表8 活性炭与抗坏血酸抑制褐变效果比较

2.5 6-BA对原球茎增殖的影响

试验发现：当6-BA浓度为1.0 mg/L时，原球茎长势较差，数目较少，且一部分分化成小苗；当6-BA浓度为3.0 mg/L时，原球茎增殖数目较多，但其中有许多发生了变异；当6-BA浓度为2.0 mg/L时，原球茎长势较为旺盛，且无变异，分化成小苗的也较少。

2.6 6-BA、NAA对试管苗生成的影响

如表9所示：处理3形成试管苗的百分比最多，达88%；处理9次之，形成试管苗的百分比达76%；处理7最少，形成试管苗的百分比达10%。

表9 6-BA、NAA对试管苗生成的影响

2.7 不同浓度NAA对蝴蝶兰生根的影响

如表10所示，当NAA浓度为1.0 mg/L时，蝴蝶兰生根数量最多，生根率达100%。

表10 不同浓度NAA对蝴蝶兰生根的影响

3 结论与讨论

在蝴蝶兰组织培养中，H培养基对蝴蝶兰叶片原球茎的诱导效果好于其他培养基。叶片诱导原球茎的效果好于根尖诱导的原球茎。温度24℃、光照强度1 000 lx、光照时长12 h/d的培养条件较适合原球茎生长。在培养过程中加入适量活性炭不仅能有效地抑制褐变产生，而且可起到壮苗作用。在原球茎增殖中，6-BA浓度为2.0 mg/L时增殖效果好。当6-BA浓度为0.5 mg/L、NAA浓度为0.1 mg/L时，形成的试管苗数量最多。当NAA浓度为1.0mg/L时，生根数最多。

在蝴蝶兰组织培养中，切块较大的外植体组织培养成功的概率大于切块小的外植体。幼嫩的根尖、叶片更容易诱导出原球茎，且褐变率较少，同时，在外植体培养初期进行1周的暗培养也可以减少褐变发生。在切块细小、稀疏的培养瓶内，群体生长较慢，而在切块较大且密集的培养瓶内，群体生长旺盛，表现出一定的群体生长效应[3]。另外，在培养过程中加入适量的椰乳、香蕉可增加培养的成功率。蝴蝶兰的实验室资源保存以原球茎继代培养方式为宜，但时间不能太长，最多2～3年，之后要进行原球茎的重新诱导，以免产生变异植株。