蛋白质生物标志物在膀胱癌发生发展中的作用机制研究进展

王英鹏，杨晓峰

1山西医科大学第一临床医学院，太原 030000

2山西医科大学第一医院泌尿外科，太原 030000

膀胱癌是泌尿系统第二大恶性肿瘤和第二常见致死原因[1]。根据临床病理特征，可将膀胱癌分为非肌层浸润性膀胱癌（non-muscle invasive bladder cancer，NMIBC）及肌层浸润性膀胱癌（muscle invasive bladder cancer，MIBC），其中，MIBC是膀胱癌患者肿瘤特异性死亡的主要原因[2-3]。虽然NMIBC患者的生存率比MIBC高，但30%～50%的NMIBC患者都会复发，10%～20%的复发将进展为MIBC[4]。因此，寻找新的有效标志物来预测膀胱癌的治疗效果和预后具有重要的临床意义。蛋白质比基因和RNA转录物能更好地反映细胞行为，蛋白质分子功能的改变与肿瘤的发生发展过程有着密不可分的关系。因此，对人膀胱癌组织样本进行蛋白质组学分析成为寻找生物标志物的一种可行方法。寻找有效可用的生物标志物，不仅要发现标志物与膀胱癌预后的关系，更要探索该标志物在肿瘤发生发展中的机制，才能更好地去指导临床。现结合国内外相关文献，对蛋白质生物标志物在膀胱癌发生发展中的作用机制研究进展进行综述。

1 凝溶胶样加帽蛋白（capping actin protein，gelsolin like；CAPG）

CAPG是凝溶胶蛋白/绒毛蛋白家族的成员，它与肌动蛋白结合，并以钙依赖的方式调节细胞质和细胞核的结构。已经确定，细胞质中的CAPG影响细胞运动。在正常情况下，推测CAPG对细胞具有冗余效应，该蛋白的失活仅显示细胞功能的轻微缺陷。在病理条件下，CAPG通过调节肌动蛋白丝的周转来控制细胞侵袭[5]。

1.1 CAPG与膀胱癌预后的关系

目前，关于CAPG与肿瘤临床疗效及预后关系的报道逐渐增多，在许多其他肿瘤领域，肌动蛋白调节蛋白被认为是潜在靶点，已经发现CAPG的表达水平与人胶质细胞瘤[6]、肝细胞肝癌[7]等肿瘤的迁移性和侵袭性呈正相关，高CAPG表达预示着肿瘤患者的不良预后。然而关于CAPG在膀胱癌中的临床意义及与预后关系的报道还很少。一项包括113例患者的研究表明，膀胱癌及癌旁组织中CAPG表达水平明显高于正常膀胱组织，且CAPG蛋白和CAPGmRNA高表达与肿瘤大小、TNM分期、肿瘤分级和无复发生存期显著相关[8]。而Lyu等[9]的研究发现，CAPG过表达与T分期及M分期无关，但与家族史、淋巴结转移和病理分级相关，这可能与两项研究采用的蛋白质分析方法不一样相关。基于这两项研究及以下CAPG在膀胱癌中的作用机制，可以相信CAPG不仅是潜在的预后生物标志物，也可作为治疗膀胱癌的可能靶点。

1.2 CAPG高表达抑制Hippo信号通路

Hippo信号通路是一种高度保守的发育通路，其核心是由哺乳动物Hippo同系物巨噬细胞刺激蛋白1/2（macrophage stimulating 1/2，MST1/2）和大肿瘤抑制基因1/2（large tumor suppressor 1/2，LATS1/2）组成的激酶级联反应，在限制器官大小、肿瘤抑制、组织再生和干细胞自我更新方面发挥着重要作用[10]。Lyu等[9]首次在膀胱癌中发现CAPG过表达使Hippo信号通路核心组分LATS1和其共激活因子单极纺锤体-结合蛋白1（mps one binder kinase activator protein 1，MOB1）去磷酸化，导致Hippo信号转导失活，进一步引起Hippo信号通路下游效应物Yes-相关蛋白（Yes-associated protein，YAP）磷酸化降低，YAP移位入核并起到转录共激活因子的作用。另一方面，移位入核的YAP可与转录增强相关结构域转录因子（TEA do-main transcription factor，TEAD）结合并激活致癌基因，从而引起膀胱癌。同时发现YAP抑制剂维替泊芬可抑制体内的YAP移位入核，抑制肿瘤生长。然而目前调节Hippo通路的上游信号在很大程度上是未知的。已经表明的是，影响F-肌动蛋白细胞骨架的各种操作可以调节Hippo通路[11]。因此CAPG是否还可以通过F-肌动蛋白或其他因素抑制Hippo信号通路还需要进一步探索。

1.3 CAPG诱导上皮-间充质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）

EMT是上皮细胞通过特定程序转化为具有间质表型细胞的生物学过程，是导致静止上皮细胞获得作为单细胞迁移和侵袭能力的重要过程，其在各种人类疾病，尤其是在肿瘤中具有关键作用[12-13]。Lyu等[9]在探索CAPG在膀胱癌中作用机制的研究中发现，在CAPG高表达时，间充质标志物（波形蛋白和N-钙黏蛋白）的表达上调，上皮标志物（E-钙黏蛋白和β-连环蛋白）的表达下调，并通过体内及体外细胞系实验证实了CAPG可作为EMT的诱导因子，增强膀胱癌的迁移及侵袭能力。这为CAPG作为潜在的膀胱癌预后生物标志物提供了一定的证据。但该研究仅是发现了这一现象，并未深入探究CAPG是通过何种途径来诱导EMT。目前关于CAPG与膀胱癌临床疗效及预后关系的报道还很少，单独或者联合其他预后标志物辅助临床医师做出正确的预后判断还需大量且深入的研究来提供证据支持。

2 异质核糖核蛋白 F（heterogeneous nuclear ribonucleoprotein F，hnRNP-F）

hnRNP-F属于hnRNP家族的RNA结合蛋白，其功能涉及RNA代谢和基因表达调控的多个步骤，例如可变剪接、mRNA稳定化、转录调控和转录后修饰[14]。hnRNP-F被证明在包括膀胱癌在内的许多肿瘤中发挥致癌作用[15]。

2.1 hnRNP-F结合靶向爪蟾驱动蛋白样蛋白 2（targeting protein for Xenopus kinesin-like protein 2，TPX 2）促进肿瘤细胞增殖

TPX2是一种微管相关蛋白，参与细胞周期并主要在G1/S期转换的增殖细胞中表达[16-17]，并被证明可调节细胞周期蛋白D1和p21的表达，在包括膀胱癌在内的各种肿瘤中发现TPX2显著异常表达，促进肿瘤细胞的增殖和转移[18]。hnRNP-F和TPX2蛋白之间的关系由Li等[19]首次报道，指出TPX2是hnRNP-F介导的膀胱癌细胞增殖和促进细胞周期进程所必需的。TPX2是hnRNP-F的下游靶标，二者表达水平呈正相关且可物理结合。二者结合后使细胞周期相关蛋白D1表达增加和p21表达降低，促进肿瘤细胞的G1/S期转换，加速肿瘤细胞周期进程和细胞增殖。但该研究仅通过体外细胞系实验证明了hnRNP-F在膀胱癌中促进肿瘤细胞增殖，并未通过小鼠肿瘤模型来证明hnRNP-F在体内膀胱癌中是否存在同样的情况。但在接下来的一项研究中证实了hnRNP-F在体内可加速肿瘤生长和转移[22]。

2.2 hnRNP-F调节锌指蛋白转录因子 1（Snail 1）mRNA稳定性，诱导EMT

Snail1是EMT转录激活因子的核心组分之一，在EMT过程中广泛表达，是EMT的关键标志物[20]。目前，人们普遍认为Snail1是一种转录因子，通过直接抑制E-钙黏蛋白基因（一种维持上皮表型所必需的基因）来启动EMT[21]。Li等[22]首次证实hnRNP-F高表达可诱导EMT。在包括103例患者的队列研究中，利用免疫组化法（immunohistochemistry，IHC）证明了hnRNP-F的高表达与膀胱癌患者高临床T分期及预后不良有关，并建立了正交各向异性转移裸鼠模型，表明hnRNP-F在体内可加速肿瘤生长和转移，同时发现hnRNP-F与Snail1表达水平呈正相关，而其他EMT转录激活因子表达水平与hnRNP-F无关。进一步研究证实hnRNP-F与Snail1mRNA的3'-非翻译区（3'-untranslated region，3'-UTR）结合显著增加了Snail1mRNA的稳定性，促进了Snail1蛋白的表达，Snail1蛋白触发EMT，增强了肿瘤细胞的迁移和侵袭能力。

2.3 hnRNP-F表达受磷脂酰肌醇- 3-羟激酶（phosphatidylinositol 3-hydroxy kinase，PI 3 K）/蛋白激酶 B（protein kinase B，PKB，又称AKT）介导的叉头框蛋白 O 1（forkhead box O 1，FOXO 1）磷酸化调节

在各种肿瘤中，活化的PI3K磷酸化并激活AKT，AKT在广泛的细胞调节过程中发挥关键作用，如细胞增殖、侵袭、迁移和代谢[23-24]。FOXO1是PI3K/AKT下游的分子，可被磷酸化抑制[25]。研究表明，与非肿瘤性膀胱黏膜组织相比，膀胱癌组织中FOXO1表达降低，并且FOXO1与良好的预后相关，并被认为是膀胱癌中的肿瘤抑制因子[26-28]。Li等[29]通过京都基因和基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）途径分析发现，hnRNP-F与PI3K/AKT通路显著相关，且发现hnRNP-F是FOXO1的直接下游靶标，二者表达水平呈负相关。未磷酸化的FOXO1与hnRNP-FmRNA启动子区域结合可显著抑制hnRNP-F的表达，同时肿瘤细胞的增殖能力受到显著抑制。但是当前的研究受到一些限制，首先，该研究结果是在人膀胱癌细胞系EJ和UMUC-3中进行的实验，需要通过体内动物实验进一步证实。其次，该研究未考虑遗传多态性因素。因此并不能排除可能影响关联的可能性。

3 DEAD盒解螺旋体31（DEAD-box helicase 31，DDX31）/突变型 p53（mutant p53，mutp53）/表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）通路

DDX31是DEAD盒蛋白7（DEAD-box protein 7，DBP7）的人类同源物，其最初作为新的ATP依赖性RNA解旋酶在啤酒糖酵母基因组数据库（BLAST）中被鉴定出来[30]。然而迄今为止，对DDX31的生物学功能还知之甚少。p53蛋白由抑癌基因肿瘤蛋白 p53（tumor protein p53，TP53）编码，TP53突变后，mutp53不仅失去了野生型p53（wild typep53，wtp53）的肿瘤抑制功能，而且还通过调节剩余的wtp53或独立于wtp53获得促进肿瘤进展的功能[31]。

3.1 DDX31/mutp53与膀胱癌预后的关系

Daizumoto等[32]对77例膀胱癌组织标本进行p53和DDX31的IHC分析，结果显示，pT分期和病理分级与DDX31表达显著相关，而与p53无关，并且DDX31和p53蛋白均高表达的膀胱癌患者预后明显差于DDX31低表达且p53蛋白高表达的患者，在膀胱癌病例中，特别是MIBC，细胞质中DDX31的高表达和p53的高表达对应着显著较差的预后。这些发现提示着DDX31和p53的组合可能是膀胱癌预后的预测指标。

3.2 DDX31与wtp53/mutp53相互作用

Daizumoto等[32]在不伴TP53突变的人膀胱癌SW780细胞系中观察到，DDX31低表达较DDX31高表达有更高的凋亡特异性p53靶基因（p53upregulated modulator of apoptosis，PUMA）和EI24自噬相关跨膜蛋白（EI24 autophagy associated transmembrane protein，PIG8）的表达，抑制肿瘤细胞凋亡。该团队并未探究其机制，但结合该团队之前在DDX31与肾细胞癌方面的研究[33]，DDX31可能是通过与核磷脂 1（nucleophosmin 1，NPM1）相互作用来稳定wtp53蛋白水平，并且还直接与wtp53结合，从而抑制PUMA和EI24基因诱导的膀胱癌细胞凋亡。

红细胞膜蛋白条带4.1样4B（erythrocyte membrane protein band 4.1 like 4B，EPB41L4B）在具有高迁移潜能的肿瘤细胞（如转移性黑色素瘤）中上调，并促进肿瘤进展和转移[34]。核DDX31、mutp53、Sp1转录因子（Sp1 transcription factor，SP1）形成复合物使mutp53获得肿瘤促进功能，结合并增强其靶基因EPB41L4B的表达，从而促进膀胱癌细胞侵袭和迁移。

3.3 DDX31、核仁素（nucleolin，NCL）和EGFR的三联体调控EGFR/AKT信号通路

NCL是一种多功能穿梭蛋白，存在于细胞核、细胞质和某些类型的细胞表面，且DDX31、磷酸核仁素（p-NCL）和EGFR形成的三联体与结肠癌的转移有关[35]。EGFR/AKT信号通路的激活参与了膀胱癌细胞的侵袭行为[36]。Daizumoto等[32]在伴有TP53突变的人膀胱癌UM-UC-3细胞系中观察到，DDX31、p-NCL、EGFR形成三联体，起到了稳定EGFR的作用，从而促进EGFR/AKT信号转导的EGF配体非依赖性组成激活，并导致伴有TP53突变的MIBC细胞进展。并且该团队制备了DDX31肽，可明显抑制DDX31-NCL复合物的形成，成功抑制了小鼠体内肿瘤的生长。可见DDX31肽是治疗晚期MIBC的一种有效药物。

4 脂肪量和肥胖相关蛋白（fat mass and obesity-associated protein，FTO）

FTO是一种常见的N6-甲基腺嘌呤（m6A）去甲基化酶，FTO的高表达与肥胖关系密切[37]，而且已被证明在胃癌、宫颈鳞状细胞癌和膀胱癌中具有促癌活性[38-40]。

4.1 FTO与膀胱癌预后的关系

Zhou等[41]对20例膀胱癌组织标本进行了IHC分析，指出在膀胱癌组织中FTO的表达水平较正常尿路上皮组织显著提高，并鉴定了人膀胱癌细胞系（T24、5637）中的FTO高表达，同时指出FTO的表达与TNM分期相关且FTO高表达患者的T分期较高。Tao等[40]对144例膀胱癌组织标本进行IHC分析后也给出了相似意见，指出FTO高表达的膀胱癌患者的总体生存率降低，FTO蛋白表达与膀胱癌患者的吸烟情况、病理分期和pT分期显著相关。但是Wen等[42]给出了不同意见，其分析了30例膀胱癌组织与正常对照组之间FTOmRNA的表达，发现FTOmRNA在膀胱尿路上皮癌组织中显著下调，蛋白质印迹分析显示与正常膀胱上皮细胞系相比，膀胱癌细胞系（5637、T24）中FTO表达降低，并且FTO在Ⅱ～Ⅳ期膀胱癌中的表达水平显著下调。这可能与标本来源以及细胞培养基不同有关，相较前两项研究的细胞培养基，后者在胎牛血清培养基中添加了1%青霉素和链霉素。

4.2 FTO通过FTO/miRNA-576/细胞周期蛋白依赖性激酶 6（cyclin dependent kinase 6，CDK 6）通路以m 6 A依赖的方式促进肿瘤增殖

RNA甲基化修饰占所有RNA修饰的60%以上，m6A是mRNA和长链非编码RNA（long noncoding RNA，lncRNA）水平上最常见的修饰之一。这种修饰的异常调节与许多恶性肿瘤的发生和发展密切相关[43]。Zhou等[39]通过体外细胞系实验及小鼠肿瘤模型证实了FTO高表达可促进肿瘤组织的生长，而miRNA-576的高/低表达明显逆转了FTO低/高表达对细胞增殖和集落形成能力的影响，证明了二者存在直接关系。miRNA-576可与CDK6mRNA的3'-UTR结合位点结合，抑制CDK6的表达，而CDK6过表达可促进细胞增殖并降低DNA修复能力[34]，从而促进肿瘤细胞的迁移和侵袭。

4.3 FTO改变肺腺癌转移相关转录本 1（metastasis associated lung adenocarcinoma transcript 1，MALAT 1）的m 6 A水平并促进膀胱癌进展

MALAT1广泛表达于人类正常组织，并在恶性肿瘤组织及血浆中出现异常表达，几乎参与基因调控过程的各个层面。越来越多的研究表明，MALAT1在肝细胞肝癌、非小细胞肺癌、胃癌、宫颈癌、膀胱癌以及结肠癌等多种肿瘤组织中表达量升高[44]，与恶性肿瘤的发生、增殖、转移、侵袭、预后等密切相关。Tao等[40]首次阐述了FTO基于其去甲基化的能力减少MALAT1mRNA 5'-末端的m6A修饰，从而延长MALAT1mRNA的半衰期，促进了膀胱癌进展。并且当抑制小鼠肿瘤中的FTO，可发现肿瘤组织的生长明显受到限制。同时发现了miRNA-384模拟物可抑制MALAT1的表达，明显延长小鼠存活时间，但并未进行miRNA-384在高表达状态下是否仍存在相同结果的研究。

5 小结

近年来，关于蛋白质生物标志物与膀胱癌关系的研究日益增多，也证实了很多蛋白质生物标志物与膀胱癌预后相关。但目前，临床判断膀胱癌患者的预后依然是根据肿瘤大小、TNM分期、病理学分级及是否存在淋巴结转移等来进行粗略预测，尚未开始大规模应用生物标志物来判断患者的预后，其原因可能是因为膀胱癌异质性较强。综上所述，可以看到膀胱癌组织中的蛋白质生物标志物可以存在多种不同作用机制，同时，一种生物标志物可以存在多种不同的作用机制，这可能是利用生物标志物判断预后效果较差的原因之一。存在多种不同致癌路径也可能与肿瘤异质性相关。随着分子生物学及精准医学的发展，会对了解蛋白质生物标志物在膀胱癌中的作用及改善患者预后提供极大帮助。