异基因造血干细胞移植后人巨细胞病毒再激活的主要分子事件

韦爱萍 宋雅琴 周秀英 彭薇 谢政军

人巨细胞病毒（human cytomegalovirus，HCMV）是一种双链DNA病毒，属于β疱疹病毒家族，其双链DNA基因组长度约为230 kb，结构复杂。HCMV原发感染后，病毒在骨髓CD34+干/祖细胞、单核细胞和树突状细胞等细胞中建立潜伏感染。在被感染的个体中，HCMV通过建立一个潜在的细胞储存库来保持潜伏状态，其中少量病毒不定时、间歇性激活进入裂解周期，从而保持终身的潜伏感染。HCMV感染机体可能经历初次感染、潜伏、再激活过程，在免疫缺陷的异基因造血干细胞移植（allogeneic hematopoietic stem cell transplantation，allo-HSCT）受者中再激活，可表现为HCMV性肺炎、胃肠炎、肝炎、视网膜炎等巨细胞病毒病（cytomegaloviral disease，CMVD）。HCMV感染还可增加allo-HSCT受者细菌、真菌感染风险，以及移植物抗宿主病（graft-versus-host disease，GVHD）等非复发相关死亡的发生风险[1-2]。HCMV在实体器官移植中的再激活率为16%～56%，而在allo-HSCT中则高达30%～70%[3-5]。近年来，由于对allo-HSCT受者预防性使用抗病毒药物及结合外周血病毒DNA监测进行的抢先预防治疗，CMVD发生率有所下降。然而，对多重耐药及复发或难治性HCMV感染的控制仍较棘手。现有的抗病毒手段多数是针对病毒再激活后引起的病毒血症，而对潜伏感染的HCMV无效，最近关于如何从潜伏状态控制病毒成为CMVD防治的新热点。预处理、免疫抑制剂使用、造血重建等导致allo-HSCT受者出现机体免疫缺陷及体内HCMV发生再激活与病毒基因组即刻早期（immediate early，IE）基因表达相关，同时启动下游与病毒裂解增殖相关的系列蛋白表达，从而导致病毒的大量复制。病毒转录、复制过程涉及诸多信号通路，本文就这些信号通路综述如下。

1 引起allo-HSCT术后HCMV再激活的危险因素

allo-HSCT受者免疫力在较长的时间内处于低下状态，尤其在术后100 d内，而此期间HCMV往往会发生再激活。已有较多的研究分析与allo-HSCT后HCMV再激活有关的危险因素。

1.1 HCMV血清学状况

供者/受者（donor/recipient，D/R）HCMV血清学状况是allo-HSCT术后HCMV感染的主要危险因素[6-7]。其中，D-/R+是发生HCMV感染的高危因素，其次为D+/R-和D+/R+[8]。然而，即使是D-/R-也不能完全避免CMVD的发生。

1.2 HLA匹配程度

人类白细胞抗原（human leukocyte antigen，HLA）位点中与allo-HSCT关联较大的包括HLA-A、B、C和DR，表达 HLA-B14、HLA-DRB1*01及HLADRB1*13的受者allo-HSCT后HCMV的感染率明显增高，而表达HLA-A11及HLA-DRB1*04的受者则较低。

1.3 造血干细胞来源

研究证明，外周血allo-HSCT术后持续性HCMV抗原血症的发生率明显低于骨髓allo-HSCT，这可能是由于不同移植物移植后的免疫重建次数不同所致。在脐带血allo-HSCT中，移植的T细胞是幼稚的，免疫重建延迟，HCMV感染的风险增加[9]。

1.4 预处理方式及免疫抑制方案

清髓预处理方案比减少强度或非清髓方案更具有细胞毒性，引起T细胞功能障碍更为严重，HCMV感染的风险也较高[10]。同时使用大剂量抗胸腺细胞球蛋白、糖皮质激素、环孢素可抑制T细胞的活化，损害免疫系统，促使HCMV再激活。

1.5 移植物抗宿主病

单因素分析显示移植后0～Ⅰ级急性GVHD（acute GVHD，aGVHD）患者HCMV感染率为51.9%，Ⅱ～Ⅳ级aGVHD患者感染率为92.3%[10]。多变量分析证明Ⅱ～Ⅳ级aGVHD患者HCMV感染率更高[11]。HCMV再激活被发现是aGVHD的独立危险因素[12]。而慢性GVHD（chronic GVHD，cGVHD）与HCMV再激活相关性较小。

1.6 中性粒细胞减少的时间

移植时的复发或难治性疾病类型和中性粒细胞减少时间是与HCMV再激活显著相关的两个变量。然而，在多因素分析中，仅中性粒细胞减少时间（超过7 d）与HCMV感染有显著的相关性[13]。

1.7 其 他

年龄，合并细菌、真菌感染，既往HCMV感染及治疗情况，移植物中CD3+T细胞比例，都与HCMV再激活有关。

2 维持HCMV潜伏感染相关的分子变化

HCMV潜伏期是指不产生子代病毒的情况下维持病毒基因组，仅转录数量有限的微小核糖核酸（microRNA）和蛋白质，但具有重新复制激活的能力。HCMV的潜伏感染与机体细胞信号调节、感知和分化有关。HCMV潜伏期的建立和维持的关键是抑制主要即刻早期启动子/增强子（major immediate early promoter/enhancer，MIEP）的表达。HCMV在潜伏状态下通过激活表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）/磷脂酰肌醇-3-激酶（phosphatidylinositol-3-kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）和Src、PI3K/核因子（nuclear factor，NF）-κB等信号通路，保持“低毒性”感染[12]。EGFR可调节潜伏期HCMV基因组转录决定因子UL138的表达，受体酪氨酸激酶（receptor tyrosine kinase，RTK）和PI3K信号在HCMV潜伏期起着关键作用，而EGFR或PI3K信号的丢失可增强HCMV再激活的潜能[14]。US28是建立潜伏期所必需的[15]，其主要功能是抑制丝裂原活化蛋白激酶（mitogenactivated protein kinase，MAPK）和NF-κB信号，从而抑制MIEP活性和防止IE基因的裂解表达[16]。利用US28特异的融合毒素蛋白（F49A-FTP）靶向并杀死HCMV潜伏感染的靶细胞，包括CD34+干/祖细胞，可降低HCMV再激活的发生[17]。HCMV可通过减弱激活蛋白（activating protein，AP）-1的活性及表达，促进潜伏感染[18]。骨髓造血干细胞是一个动态分化的异质细胞群，伴随干细胞的分化，潜伏的HCMV复制和转录可发生动态变化，髓系分化及激活途径与HCMV再激活均有一定关联。HCMV潜伏转录组是一个广泛研究的领域，目前许多潜伏相关基因的确切作用尚不清楚。免疫、稳态或应激状态的变化均可刺激HCMV基因组表达的改变，从而导致HCMV潜伏感染再激活的发生。

3 MIEP过表达在HCMV再激活过程中的关键作用

MIEP是HCMV从潜伏状态重新激活的关键控制区，其过表达是启动病毒裂解周期的关键。在潜伏期内，IE基因的表达受到抑制，导致病毒基因表达减少，病毒复制处于“停滞”状态[19]。IE基因表达启动，则HCMV重新进入病毒复制周期[20]。这种IE基因的去抑制被认为是控制潜伏状态和再激活之间切换的关键事件。HCMV复制的两个关键调节因子是IE1和IE2，均受MIEP的调控[21]。IE1和IE2在整个HCMV感染过程中持续动态表达，并通过改变细胞和病毒基因的表达，抑制免疫应答。allo-HSCT后IE基因的表达与HCMV再激活有关[22]。在HCMV感染的背景下，IE1和IE2的5’端非翻译区是高效表达IE1和IE2蛋白以及HCMV复制所必需[23]。IE72和IE86在HCMV基因表达和感染阶段具有广泛而重要的作用[24]。有研究表明，干扰素-γ诱导蛋白（interferon-γ inducible protein，IP）衍生转录本是病毒IE基因表达的主要驱动因素，是HCMV激活复制的必要条件，且在MIEP激活之前发生[25]。多个转录单位包括NF-κB、EGFR、MAPK/细胞外调节蛋白激酶（extracellular regulated protein kinases，ERK）、PI3K/Akt、AP-1、环磷酸腺苷效应元件结合蛋白（cyclic adenosine monophosphate response element-binding protein，CREB）、Janus激酶（Janus kinase，JAK）/信号转导子和转录激活子（signal transducer and activator of transcription，STAT）、 特异性蛋白（specificity protein，Sp）1、pp71、pp65和pTRS1等，在HCMV裂解复制过程中协同调节IE1和IE2的表达[26]。

allo-HSCT受者机体环境可刺激HCMV MIEP的激活和启动IE基因的转录，从而促进炎症反应信号通路包括NF-κB、AP-1、JAK/STAT和ERK/MAPK等不同程度的激活或抑制，并与MIEP结合[27]。激活控制MIEP活性和HCMV染色质重塑的转录因子，启动IE基因的转录，是HCMV再激活的必要条件。已知组蛋白乙酰转移酶（histone acetyltransferase，HAT）在调节MIEP表达和重新激活HCMV方面起重要作用，用药物MG149抑制HAT活性可减少潜伏期的HCMV再激活[28]。组蛋白去乙酰化酶（histone deacetylase，HDAC）4在潜伏感染的细胞中上调，并与MIEP过表达相关，HDAC抑制剂能够逆转MIEP的组蛋白去乙酰化，抑制MIEP的表达[29]。溴结构域和域外终端蛋白抑制剂如GSK1324726A，在诱导控制潜伏感染HCMV的CD14+单核细胞表达IE基因方面远远优于HDAC抑制剂，是控制HCMV潜伏感染的再激活有效治疗手段[30]。

4 参与allo-HSCT术后HCMV再激活的分子通路

allo-HSCT所致免疫缺陷及产生的炎症内环境变化，可引起机体HCMV裂解复制和增殖，导致HCMV再激活[31]。以上机体内环境变化诱导参与免疫反应中一系列复杂基因的表达，包括激活转录因子及其相应分子通路，诱导MIEP的表达，从而激活HCMV。

4.1 肿瘤坏死因子/NF-κB信号通路

NF-κB 是 由 p65/rela、p50、p52、c-rel和 relB亚基组成的同二聚体和异二聚体混合物，在细胞增殖、免疫和炎症反应中起着重要作用。NF-κB信号通路可被炎症因子[肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF）-α等]、病毒感染和氧化应激等激活。HCMV再激活与产生炎症环境的条件有关，而allo-HSCT过程产生的炎症环境可使炎症因子通过NF-κB介导MIEP的表达。allo-HSCT上调TNF-α的表达激活NF-κB信号通路，进而刺激HCMV IE基因的转录，导致机体潜伏感染的HCMV再激活[27]。p65/rela和relB均在allo-HSCT术后迅速激活，其他包括JAK/STAT信号通路也被激活[27]。干扰素β可以防止潜伏感染细胞中HCMV再激活[32]。TNF-α可通过NF-κB信号通路重新激活潜伏期HCMV DNA复制，在allo-HSCT情况下，还可能会加剧GVHD，阻碍造血重建，进一步促进HCMV再激活[33]。槲皮素、金色草素、章鱼胺等可通过阻断NF-κB信号通路下调TNF-α等的表达，诱导靶细胞凋亡和抑制炎症反应，这可能是治疗及预防HCMV再激活的有效策略，其作用机制有待进一步研究[34-36]。

4.2 EGFR信号通路

EGFR是细胞增殖、分化的主要稳态调节因子。pUL135和pUL138可通过EGFR信号通路调节病毒裂解周期，骨髓CD34+干/祖细胞病毒基因差异表达提示UL135与UL138功能的拮抗作用[37]。pUL138通过维持受感染细胞的EGFR表达水平和活性来保持宿主HCMV潜伏状态，而pUL135则通过调节细胞表明EGFR的表达促进HCMV复制和激活[14]。其中UL138可介导细胞多药耐药相关蛋白（multidrug resistance-associated protein，MRP）-1下 调，MRP-1是一种细胞表面蛋白，阿霉素和长春新碱等通过UL138介导MRP-1的下调，可作为抗肿瘤药物，长春新碱能靶向并杀死HCMV潜伏感染的单核细胞和CD34+干/祖细胞[38]。然而，长春新碱的器官毒性限制其作为针对HCMV潜伏感染再激活的治疗手段。HCMV可下调EGFR的表达，使其下游通路的激活受到抑制。抑制EGFR下游的丝裂原活化蛋白激酶激酶（mitogen-activated protein kinase kinase，MEK）/ERK、STAT或PI3K/Akt信号通路可促进HCMV在骨髓CD34+干/祖细胞中的激活[39]。allo-HSCT受者在机体的造血重建过程中，可通过EGFR信号通路使潜伏在骨髓CD34+干/祖细胞中的HCMV再激活。

4.3 PI3K/Akt信号通路

PI3K/Akt信号通路参与调控细胞的增殖和分化，包括病毒感染、复制、潜伏和再激活[40-41]。HCMV基因组中GB、IE1和IE2均可触发PI3K/Akt信号传导。PI3K/Akt信号通路对于机体病毒的感染以及其免疫系统对病毒的控制起着至关重要的作用[42]。HCMV感染可通过上调PI3K/Akt通路，促进IE基因的表达和MIEP的激活[43-44]。Akt的持续过度激活会导致终末分化效应CD8+T细胞增多，记忆性CD8+T细胞减少，导致机体对HCMV感染的免疫控制减弱[45]。缺血-再灌注损伤可激活PI3K/Akt信号通路[46-47]。allo-HSCT所致缺血-再灌注损伤使PI3K/Akt信号表达上调，促进MIEP表达，导致HCMV再激活。缺血-再灌注损伤及免疫缺陷交互作用可加重allo-HSCT后CMVD的发生发展。PI3K/Akt信号通路可促进骨髓造血干细胞的分化，致其中潜伏状态HCMV再激活风险增加[48]。同时，PI3K/Akt信号通路的过度激活与aGVHD的发生有关，间接增加HCMV再激活的风险[49]。PI3K抑制剂（leniolisib、LY294002）可降低靶细胞IE基因的表达，改善免疫失调，防止HCMV再激活[50-51]。

4.4 AP-1信号通路

AP-1家族是由Fos、Jun、Maf和ATF成员组成的二聚体复合体。AP-1与MIE启动子结合是控制HCMV再激活的关键分子过程，AP-1在MIE启动子近端AP-1结合位点的募集可激活多个MIE启动子的表达，包括停靠蛋白（docking protein，DP）、MIEP和IP2，驱动IE基因转录，促进HCMV再激活。通过破坏机体MIE启动子近端的AP-1结合位点，可观察到HCMV再激活的能力下降[18]。AP-1在正常组织中表达水平较低，allo-HSCT移植后AP-1家族多个成员迅速激活，如c-Fos、JunD、c-Jun[27]。allo-HSCT过程中免疫抑制剂使用等可造成血管微环境损伤，引起局部组织缺血缺氧，AP-1可被诱导表达促进血管的生成及发育[52]。allo-HSCT后由于缺血-再灌注损伤导致活性氧物种形成，进而激活AP-1信号通路，引起HCMV潜伏再激活。哌唑嗪在小鼠心肌细胞缺血-再灌注中可降低炎症因子的表达水平，使AP-1的活性及表达下调，从而发挥保护作用[53]。姜黄素是AP-1抑制剂，可下调缺氧诱导的前脂肪细胞因子（preadipocyte factor，Pref）-1表达[54]。以上药物是否可通过AP-1信号通路在allo-HSCT受者HCMV感染及再激活中发挥防治作用有待进一步研究。

4.5 环磷酸腺苷/蛋白激酶A信号通路

环磷酸腺苷反应元件（cyclic adenosine monophosphate response element，CRE） 是 人 类 上百个基因启动子中的转录调控序列。CREB是一种转录因子，当其被招募到MIE启动子结合位点时，可促进HCMV DNA的复制。环磷酸腺苷（cyclic adenosine monophosphate，cAMP）/蛋白激酶A（protein kinase A，PKA）信号的刺激使CREB活化，从而促进CRE依赖的MIE启动子转录增强，激活并启动HCMV裂解周期[55]。CREB活性受疱疹病毒编码的跨膜G蛋白偶联受体（G protein coupled receptor，GPCR）调控，病毒GPCR可“劫持”机体各种信号通路和细胞内信号传导。HCMV编码的GPCR包括US28、UL33、UL78和 US27，可促进 CREB的激活[56]。UL33信号还可诱导细胞内CREB的磷酸化，导致HCMV重新激活复制，用666-15抑制CREB磷酸化可降低HCMV再激活[57]。allo-HSCT受者由于炎症反应和氧化应激使机体微环境改变，进而激活cAMP/PKA信号通路，促进IE基因的表达，从而导致HCMV再激活[6]。以病毒GPCR为靶点的治疗方案，可通过调节其对宿主细胞信号通路的干扰，从而有助于控制HCMV再激活。

4.6 JAK/STAT信号通路

HCMV的免疫逃逸策略之一是干扰感染细胞中JAK/STAT信号传导。病原体感染会诱导机体表达干扰素，干扰素通过STAT发出信号，使机体建立抗病毒状态[58]。HCMV通过下调STAT 2信使核糖核酸（messenger RNA，mRNA）的表达而干扰Ⅰ型干扰素信号通路[59]。STAT 2对鼠巨细胞病毒（murine cytomegalovirus，MCMV）DNA的复制具有拮抗作用，在STAT 2缺陷小鼠，MCMV复制增加，导致感染后第1周死亡[58]。HCMV主要利用去磷酸化的STAT 3促进HCMV DNA复制[60]。allo-HSCT可干扰JAK/STAT信号通路，导致HCMV重新激活。allo-HSCT后JAK/STAT信号通路被激活，可介导HCMV发生免疫逃逸，在机体免疫缺陷的情况下，加速HCMV再激活。STAT1抑制剂（氟达拉滨）或STAT3抑制剂（S3I-201）可降低外周血HCMV载量[39]。氟达拉滨对B细胞慢性淋巴细胞白血病疗效显著，采用氟达拉滨治疗的白血病患者对allo-HSCT后HCMV再激活是否具有抑制作用需进一步研究。

其他相关信号通路还包括Src、MAPK/ERK、Src家族激酶（Src family kinases，SFK）和造血细胞激酶（hemopoietic cell kinase，HCK）等，均可介导病毒IE基因的表达，参与机体HCMV的再激活。而各通路之间是否存在交叉机制还有待于进一步研究。

5 小 结

allo-HSCT后造血免疫重建过程中机体潜伏状态的HCMV发生多个分子事件改变，从而触发HCMV表观遗传变化、转录及信号通路激活，导致HCMV再激活。现阶段，HCMV再激活所致CMVD是allo-HSCT术后非复发相关死亡的主要病因，现有的防控手段仍存在耐药、不良反应大和病毒株变异等难点，迫切需要新的预防和管理策略。如何阻断HCMV再激活相关通路，控制机体处于潜伏期，从而避免HCMV再激活形成病毒血症，在更早阶段控制HCMV复制，可能是今后防治CMVD的新方向。