峨眉黑鸡遗传多样性及群体遗传结构分析

袁 霞，刘方庆，文陇英，徐 婧，廖光祥，王强胜，王 湘

（西南山地濒危鸟类保护四川省高等院校重点实验室/乐山师范学院，四川乐山 614000）

生物多样性由遗传多样性、物种多样性和生态系统多样性三个部分组成，既包括生物个体及其携带的遗传信息，也包括它们与生态环境所组成的生态系统，以及各组分间的相互联系[1]。遗传多样性可以作为进一步分析生物个体在遗传进化方面的潜能和对环境的适应能力等各方面特征的重要基础数据之一[2]。一个地区的物种遗传多样性越丰富，该物种对环境的适应能力越强，在生存和进化方面也具有更大的优势[3]。

地方家禽种质遗传资源是畜禽遗传多样性的重要组成部分，是对地方禽类进行品种改良和可持续开发利用的重要依据[4]。随着国内经济的快速发展，引进外来种类（品种）逐渐增多；这些外来优良资源在丰富当地畜禽品种资源的同时，也会对当地原有畜禽品种资源多样性的保护造成冲击和破坏[5]。例如我国本土猪在大量引进进口白猪的情况下，面临着逐年减少甚至灭绝的情况[6-7]。地方品种虽然在生产性能方面比不上引进品种，但其优良的肉质品质和独特的风味远远优于引进品种，尤其是我国地方禽畜品种资源在遗传育种方面还可能具有较高的研究利用价值[8]。通过研究家禽的遗传结构多样性和家禽群体遗传距离可以初步查明家禽各种类型间的共同起源历史及亲缘关系，对合理地使用资源及有效保存家禽地方品种资源、建立优良基因库有着重要的参考意义，是家禽遗传资源管理中的重要环节[9]。

峨眉黑鸡（Gallus gallus）为原鸡属红原鸡种的一个地方亚种，是一种肉蛋兼用型品种，不仅具有丰富的营养价值，还兼有药用价值和观赏价值，是四川峨眉山地区养殖数量较多的黑鸡优秀品种；属于四川山地乌鸡的两大品系之一[10]。峨眉黑鸡主要分布在峨眉山市的龙池、大为、龙门，乐山市沙湾区的范店、轸溪及峨边县的毛坪、共和等乡镇；主产区为峨眉山西南大渡河沿岸的三县交界处[11]。

峨眉黑鸡全基因组重测序实现了遗传进化分析及重要性状候选基因的预测[12]，但针对其遗传多样性及品种形成的历史研究内容还较少。目前，以mtDNA 序列为分子标记运用DNA 直接测序的方法，研究家禽遗传多样性[13-18]和系统分化[19-22]及起源的研究报道越来越多。本研究通过以峨眉山特有鸡种峨眉黑鸡作为研究对象，以线粒体DNA 细胞色素c 氧化酶亚基I(cytochromecoxidase I,COI)和细胞色素b(cytochromeb)两个基因为分子标记，通过采集三个地点的峨眉黑鸡群体样本，分析种群遗传多样性与遗传结构，构建系统发育树，为峨眉黑鸡种质资源的科学保存和可持续性利用提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 样品采集及DNA提取

1.1.1 样品采集

21 只峨眉黑鸡分别来自峨眉山市三个的鸡场：峨眉山市世海黑鸡原种鸡场（E1），峨眉山市远大林下放养鸡场（E2），峨眉山市鸿飞养鸡场（E3）。样品编号见表1。所有个体用含有20 μL 抗凝血剂（EDTA 和0.75%生理盐水按3%～4%比例配制而成）的抗凝管进行翅下静脉采血，采样体积为0.3 mL，放置于-20 ℃冰箱保存。

表1 峨眉黑鸡采样地点及数量

1.1.2 DNA提取

使用天根组织/血液试剂盒（北京天根）提取基因组上的DNA序列[22]。

1.2 引物信息及PCR扩增

参照文献[23]选取合适的引物（见表2）。线粒体DNA 中的Cytb基因扩增引物为Cytb-H16064、Cytb-L14731，线粒体DNA 中的COI基因扩增引物为COIL6615、COI-H7956；其中L 表示轻链，H 表示重链；序列的顺序均为5′—3′方向。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

表2 引物序列信息

以提取的基因组DNA 作为模板，进行PCR 扩增。PCR 反应体系为25 μL，包括模板DNA 2 μL、ddH2O 8.5 μL、DNA 聚合酶（Taq 酶）12.5 μL（含dNTP、Mg2+、Buffer 缓冲液）、上下游引物各1 μL，反应体系在Easycycler Gradient 96 型与SelectCycler Ⅱ型PCR 仪上进行反应[24]。

PCR 反应要求：94 ℃预变性5 min，94 ℃变性30 s，45～46 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，35 个循环；最后72 ℃延伸10 min；将扩增好的PCR 产物放于4 ℃冰箱保存备用[24]。

1.3 PCR扩增产物的纯化与测序

将扩增好的PCR 产物取4～5 μL 用1%的琼脂糖凝胶电泳检测[24]，将扩增成功的产物和相应的引物送至生工生物工程（上海）股份有限公司(成都分公司)进行分离纯化和双向测序。

1.4 数据分析

1）将获得的DNA 双向测序数据根据峰图人工校对测序结果，用DNAMAN 软件拼接、比对和剪切[25]，生成对应的线粒体COI、Cytb 全序列文件后，通过在NCBI 上执行BLAST 相似性检索，以保证得到的序列为目的基因片段。

2）用Bioedit 对DNA 序列进行比对、拼接和校正[26]。

3）用DNAsp 生成单倍型，并计算单倍型多样性(haplotype diversity，Hd)、核苷酸多样性(nucleotide diversity，Pi)及核苷酸平均差异数（Average number of nucleotide differences,K）[27]。

4）对线粒体DNACytb 和COI 这两个目的片段基因及串联成的DNA 片段分别构建以下两种系统发育树：用PAUP4.0 的邻近结合法构建NJ（Neighbor joining）树[28]；用MrBayes 3.2 的贝叶斯（Bayesian）推断法构建贝叶斯树[29]。

2 结果与分析

2.1 碱基组成

三个采样点的峨眉黑鸡基因片段的碱基组成测试结果为：COI序列片段中A+T 的百分比高于G+C，碱基G 含量最低（见表3）；Cytb序列片段A+T 含量较高，碱基C 含量最高（见表4）；串联片段中A+T 的含量高于G+C的含量（见表5）。

表3 峨眉黑鸡COI基因碱基组成 单位：%

表4 峨眉黑鸡Cytb基因碱基组成 单位：%

（续表4）

表5 峨眉黑鸡Cytb和COI基因串联片段的碱基组成 单位：%

2.2 遗传多样性

2.2.1 遗传多样性指数

COI基因有效测序长度为846 bp，其中包含549个变异位点、397个缺失位点、1个简约信息位点，两碱基变异数为1 个，三碱基变异数为1 个。共定义了12种单倍型。

Cytb基因有效测序长度为1 005 bp，其中包含554个变异位点、451个缺失位点、8个简约信息位点，两碱基变异数为5 个，三碱基变异数为3 个。共定义了6 种单倍型。

按照文献[30]提出的标准，单倍型多样性以0.5 为临界值，核苷酸多样性以0.005 为临界值，二者的值越大，群体的多样性程度越高。本测试结果（见表6～表8）显示：采样于峨眉山市世海黑鸡原种鸡场的种群（E1）在三个种群中遗传多样性最低；采样于峨眉山市远大林下放养鸡场的种群（E2）的核苷酸多样性及核苷酸平均差异数最高；采样于峨眉山市鸿飞养鸡场的种群（E3）的单倍型多样性较高，核苷酸多样性较低。

表6 峨眉黑鸡COI基因的遗传多样性指数

表7 峨眉黑鸡Cytb基因的遗传多样性指数

表8 峨眉黑鸡Cytb和COI基因串联片段的遗传多样性指数

2.2.2 遗传距离

测试结果显示，峨眉黑鸡三个地区鸡种间基因的遗传距离（DA）如下：1）Cytb基因片段，E1 和E2 两个种群的遗传距离为0.002 9，E1 和E3 两个种群的遗传距离为0.002 7，E2和E3两个种群的遗传距离为0.002 8。2）COI基因片段，E1 和E2 两个种群的遗传距离为0.000 8，E1和E3两个种群的遗传距离为0.000 4，E2和E3两个种群的遗传距离为0.000 5。

2.2.3 系统发育树

基于本研究测得的21 条峨眉黑鸡序列Dnasp 5 分析得到3 个采样地点的峨眉黑鸡COI基因序列共有11 种单倍型，Cytb基因序列共有5 种单倍型；采用邻接法（NJ）和贝叶斯推论法（BI）构建单倍型系统发育树。

COI：1）NJ树。单倍型H2、H3、H5聚在一起形成姊妹分支，H1、H4、H6、H7、H8、H9、H10、H11 单独形成一支（见图1）。2）BI 树。所有单倍型均单独形成分支（见图2）。

图1 峨眉黑鸡COI基因NJ系统发育树

图2 峨眉黑鸡COI基因BI系统发育树

Cytb：1）NJ 树。单倍型H2 和H4 聚在一起形成姊妹分支，H3和H5聚在一起形成姊妹分支，H1单独形成分支（见图3）。2）BI 树。H3 和H5 聚在一起形成姊妹分支，H1、H2、H4 均单独形成分支（见图4）。

图3 峨眉黑鸡Cytb基因NJ系统发育树

图4 峨眉黑鸡Cytb基因BI系统发育树

3 结论与讨论

3.1 结论

群体内反馈线粒体DNA 变异水平程度的两个关键要素是单倍型多样性（Hd）及核苷酸多样性（Pi），两者的值越大，表明群体的遗传多样性越丰富，群体的多样性程度也越高[31]，群体可供选择的育种素材就越多，对将来变化多端的自然环境的适应潜力也越大[32]。Cytb序列的多样性（Hd=[0.667,0.905]，Pi=[0.002 35,0.005 14]）明显高于COI序列的多样性（Hd=[0.286,0.524]，Pi=[0.000 71,0.0.001 05]），可能是由于COI基因相对保守，而Cytb基因突变率较高。对两个基因片段及串联序列多样性的计算结果显示，采样于峨眉山市世海黑鸡原种鸡场的种群在三个种群中遗传多样性最低；采样于峨眉山市远大林下放养鸡场的种群的核苷酸多样性及平均核苷酸差异数最高；采样于峨眉山市鸿飞养鸡场的种群单倍型多样性较高，核苷酸多样性较低。本研究结果表明，以原鸡（Gallus）为外群，两种分析方法得到的系统发育树的结构基本一致；来自不同地区的三个种群的单倍型未按照地理位置各自聚类，而是相互混杂在一起，进化关系不明显。

COI基因片段的遗传多样性分析显示出单倍型多样性（Hd）在0.286～0.524，核苷酸多样性（Pi）在0.000 71～0.001 05，核苷酸平均差异数（K）在0.571 43～0.857 14。总体而言，在该基因片段序列中三个种群单倍型多样性及核苷酸多样性数值较低，本片段的三个种群遗传多样性数值均较低（Pi＜0.100）。Cytb基因片段的遗传多样性分析显示出单倍型多样性（Hd）在0.667～0.905，核苷酸多样性（Pi）在0.002 35～0.005 14，核苷酸平均差异数（K）在1.809 52～4.285 71。采样于峨眉山市鸿飞养鸡场的种群单倍型多样性较高（Hd=0.905＞0.900），采样于峨眉山市远大林下放养鸡场的种群序列核苷酸平均配对差异最高（K=4.285 71）。Cytb和COI基因串联片段的遗传多样性分析显示出单倍型多样性（Hd）在0.810～0.905，核苷酸多样性（Pi）在0.001 14～0.005 14，核苷酸平均差异数（K）在1.809 52～4.285 71。采样于峨眉山市鸿飞养鸡场的种群单倍型多样性较高（Hd=0.905＞0.900），采样于峨眉山市远大林下放养鸡场的种群序列核苷酸平均配对差异最高（K=5.047 62）。

遗传距离是分析2 个不同种群或亲缘关系较近的物种之间遗传差异的一种方法，一般是利用2 个种群不同位点的等位基因频率数据来计算的[33]。本研究结果表明，无论是基于Cytb基因还是COI基因，采样于峨眉山市鸿飞养鸡场与峨眉山市世海黑鸡原种鸡场的种群遗传距离都最小（遗传距离分别为0.002 7 和0.000 4），即亲缘关系最近；采样于峨眉山市世海黑鸡原种鸡场与峨眉山市远大林下放养鸡场的种群遗传距离最大(遗传距离分别为0.000 4 和0.000 8)，即亲缘关系最远；但总体亲缘关系都较近。

3.2 讨论

研究结果表明，峨眉黑鸡的遗传多样性较低，三个地区间种群亲缘关系都较近，推测可能产生该结果的原因是由于目前进行保种的峨眉黑鸡群体是来自2002 年峨眉种鸡的少量育种群体，这些鸡种大部分来自当地的农户，与其他外来鸡种的基因交流可能性较小，所以种群亲缘关系较近，其变异程度较低；除此之外，由于基础种群数目相对较少，并且大部分在2002 年之前缺乏系统性的保种措施，小群体中的遗传漂变也可能会造成整体遗传多样性的缺失，发生在封闭群体中有效群体数量的下降也会提高基因漂变的速率，进而减少小群体的遗传多样性[34]。因此，未来为确保峨眉黑鸡的可持续性开发利用，需加强对其种质资源的保护，减少这一品种的优良性状丢失。