盐胁迫下AMF对榉树幼苗生长和光合特性的影响

马仕林，曹鹏翔，张金池*，刘 京，王金平，朱凌骏，袁钟鸣

(1.南京林业大学林学院，南方现代林业协同创新中心，江苏 南京 210037；2.江苏盐城大丰林场，江苏 盐城 224111)

盐渍土壤会对植物产生渗透及离子胁迫，造成水分亏缺及离子毒害，影响生理代谢过程，限制光合作用，抑制植物生长发育[1-2]，严重制约了沿海防护林的发展。目前盐碱地治理措施主要集中在工程、化学、农艺、生物技术等领域[3]。为了更有效、经济和环保地治理，通过生物手段提高植物在盐碱地中的生产力成为治理盐碱地的热点方向[4]。丛枝菌根真菌(arbuscular mycorrhizal fungi，AMF)作为陆地生态系统的重要组成部分，能与70%～90%的陆地植物建立共生体[5]，并能通过多种途径影响植物生理代谢[6]，进而影响植物光合作用。研究表明，菌根联合可以提高植物干物质积累[7]、养分吸收[8]、渗透调节[9]、叶绿素浓度[10]、水分利用[11]等，从而提升植物的耐盐性以及在盐碱地中的生产力。

光合作用与植物的生长密切相关[12-13]，而光响应曲线能直观地反映出光合速率与光合有效辐射的关系，对研究植物光合能力、光合潜力及生态适应性具有重要意义[14]。

榉树(Zelkovaserrata)又叫光叶榉，是榆科(Ulmaceae)榉属(Zelkova)硬阔叶乔木树种，具有重要经济和景观利用价值[15]。研究发现，过高的土壤盐分(质量分数0.5%)会损伤榉树叶片，并限制植株生长[16]，而提高叶片的光合性能则是提升盐碱地中榉树生产力的重要途径。然而，现有研究主要集中于对盐胁迫下榉树的生理生化特性及耐盐性研究[17-19]，鲜有盐胁迫下AMF对榉树光合特性影响的报道[20]，更是缺乏此条件下光响应模型适用性探究。而适宜的光响应模型所提供的准确的特征参数将有助于直接或间接反映植物光合生理过程[21]，对盐碱地林业生产有重要指导意义。为此，本研究以榉树幼苗为研究对象，于温室内接种不同AMF后，进行盐胁迫盆栽试验。通过对比分析不同处理间的差异，探索盐胁迫下AMF对榉树生长和光合特性的影响，并评定5种光响应模型的适用性，以期为利用菌根联合技术提高植物在盐碱地中的生产力提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料及试验地概况

供试榉树种子与湿沙(相对湿度60%左右)按体积比1∶3 搅拌均匀，在4 ℃冰箱内保存30 d。随后用3 g/L的KH2PO4溶液浸种24 h，75%(体积分数)的乙醇溶液浸种5 min。用无菌蒸馏水洗净种子后，在25 ℃的恒温培养箱完成催芽，并于灭菌基质土(珍珠岩与草炭土体积比1∶1混合)中培育限菌苗(无AMF侵染的幼苗)。选取苗高约10 cm、地径约1 mm，长势一致的榉树幼苗于南京林业大学下蜀实习林场(119°12′E，32°07′N)温室中进行盆栽试验。

供试菌株摩西球囊霉(Glomusmosseae)1号(分离自贵州毕节)、摩西球囊霉2号(分离自云南楚雄)及扭形球囊霉(G.tortuosum)(分离自内蒙伊金霍洛旗)由北京市农林科学院植物营养与资源研究所提供。培育榉树幼苗的同时，以玉米和三叶草为寄主，灭菌后的黄沙为基质，在人工气候室内进行AMF的扩繁。3个月后，保留含有孢子、菌丝及侵染根段的黄沙，作为接种菌剂。

1.2 试验设计

2017年6月，将供试幼苗分别接种摩西球囊霉1号(GM1)、摩西球囊霉2号(GM2)及扭形球囊霉(GO)，以不接种AMF为对照(处理N)，每种处理24盆，每盆基质约2.5 kg。盆栽基质由下蜀实习林场林地5～30 cm的表层土、黄沙以及蛭石等体积混合而成，混合基质在高温高压灭菌后于温室内放置至少2周。在温室中培育1 a作为AMF侵染期及植物生长期，期间每2个月浇Hoagland(减磷)营养液1次(每次每盆300 mL)，并适当补充无菌蒸馏水。温室的环境条件：温度18～35 ℃，相对湿度40%～80%，昼夜光周期14 h/10 h，光照强度 700～1 000 μmol/(m2·s)。

2018年6月底，检测榉树根系菌根侵染状况，确认AMF与榉树树种根系已形成良好的共生关系后，进行盐胁迫处理。GM1、GM2、GO及N 4种处理分别分成2组(每组12盆)，进行盐胁迫处理，以非盐胁迫为CK对照；盐胁迫处理每周每盆浇300 mL浓度为100 mmol/L的NaCl溶液，非盐胁迫处理以无菌蒸馏水代替NaCl溶液。试验共进行2个月，期间定期补充Hoagland(减磷)营养液。2018年9月，每种处理选取3盆进行光合特性测定；采集对应根样，进行菌根侵染率测定。

1.3 测定方法

1.3.1 菌根侵染率的测定

将存放于标准固定液中的细根洗净后，剪成约1 cm长的根段。用10% KOH(质量分数)溶液在90 ℃下漂洗60 min后，用0.05%(质量分数)曲利苯蓝溶液在70 ℃下染色。每个样随机选30个根段，在半自动数码显微镜(Leica DM5000B，Wetzlar，德国)下观察菌根侵染程度，拍照，按下列公式计算菌根侵染率[22]：

菌根侵染率=(有AMF侵染的根段数/检查总根段数)×100%。

1.3.2 生长指标的测定

于2018年6月盐胁迫前和2018年9月盐胁迫结束后用卷尺和电子游标卡尺分别测定幼苗的苗高和地径，每个处理选取3株，计算苗高净增长量和地径净增长量。

1.3.3 光合特性测定与光响应曲线绘制

在晴朗天气的9:00—11:00，每个处理选取3株长势一致的榉树，使用Li-6400型便携式光合作用测定系统(Li-COR Inc，USA)进行光合特性测定。设定测定时的叶室温度为(31±0.8)℃，叶室相对湿度为(6.3±4.4)%，光合有效辐射(photosynthetic active radiation，PAR)设置0、50、100、200、300、400、600、800、1 000、1 200、1 400、1 600、1 800及2 000 μmol/(m2·s)共计14个梯度，测定14个光合有效辐射下的叶片净光合速率，不同光合有效辐射下的测定时间为180 s。

仪器自动记录净光合速率[net photosynthetic rate，Pn,μmol/(m2·s)]、蒸腾速率[transpiration rate，Tr,mmol/(m2·s)]、胞间CO2浓度[intercellular CO2concentration，Ci,μmol/mol]等气体交换参数；计算气孔限制值(Ls)来表示光合作用的气孔限制(Ls=1-Ci/Ca，式中：Ci表示胞间CO2浓度，Ca表示大气CO2浓度)；计算水分利用效率(water use efficiency，EWUE,mmol/mol)来表示榉树叶片的水分利用效率(EWUE=Pn/Tr)[23-24]。整合处理上述数据，最终选取平均数进行分析，并绘制光响应曲线(Pn-PAR曲线)。光响应模型及其理论公式的模型拟合见表1。

表1 光响应模型理论公式及参数设置

1.4 数据处理

采用Excel 2016和Origin 8.5进行数据的整理以及绘图。单因素方差分析(Duncan检验)、双因素方差分析及光响应模型曲线拟合采用SPSS 21.0进行。

2 结果与分析

2.1 盐胁迫下菌根真菌对榉树生长的影响

苗高、地径净增长量可直观反映榉树在接菌及盐胁迫后的生长情况(表2)。双因素分析显示，盐胁迫显著降低了榉树苗高及地径净增长量(P< 0.05)，而接菌处理及其与盐胁迫的交互作用未能显著影响榉树苗高及地径净增长量。AMF对榉树苗高的促进作用主要表现在非盐胁迫条件下，CK-GM2处理下榉树苗高净增长量显著高于CK-N处理(P< 0.05)，增幅为46.88%；而AMF对地径的促进作用主要体现在盐胁迫下，Salt-GM1及Salt-GM2处理下榉树地径净增长量显著高于Salt-N处理(P< 0.05)，增幅分别为49.18%和51.37%。此外，盐胁迫显著降低了GM1及GO的侵染率(P< 0.05)，降幅分别为17.64%和19.65%，而盐胁迫对GM2的侵染率影响并不显著(表2，图1)。

表2 AMF对榉树生长影响及菌根侵染率

2.2 盐胁迫下菌根真菌对榉树光合特性的影响

净光合速率、胞间CO2浓度、气孔限制值和水分利用效率可直观反映不同处理下榉树光合特性之间的差异(图2)。本研究中，不接种情况下，盐胁迫大幅度降低榉树叶片净光合速率，同时提高了气孔限制值，降低胞间CO2浓度，小幅度降低了水分利用效率。非盐胁迫下，接菌处理能小幅提高榉树叶片净光合速率，其中，GM1处理的提升最大。盐胁迫下，3种接菌处理均能提升榉树叶片净光合速率、气孔限制值和水分利用效率，并能降低榉树叶片胞间CO2浓度，其中，GM2和GO处理较未接菌处理变化幅度最大。

2.3 盐胁迫下5种模型的光响应曲线拟合

5种模型的光响应曲线拟合结果如图3所示。模型拟合的精度可以通过相关指数(决定系数)R2的大小来判定。当R2越接近1时，该模型拟合的精度越高，其参考价值也越高。非盐胁迫条件下，5种模型均能较好地拟合榉树的光响应曲线，R2均达到0.970以上，其中叶子飘模型拟合效果最好，指数模型拟合效果最差。盐胁迫条件下只有叶子飘模型拟合中Salt-N、Salt-GM1、Salt-GM2处理的R2高于0.900，分别为0.974、0.971、0.978，拟合效果较好；其余4种模型拟合中各处理的R2均低于0.900，拟合效果较差。

3 讨 论

世界范围内，盐分对树木的消极影响广泛存在且代价昂贵[30]，这也体现在本研究中盐胁迫对榉树幼苗的苗高、地径净增长量的显著抑制作用上。针对这一问题，通过接种AMF提高植物在盐碱地中的生产力成为治理盐碱地的研究热点。研究发现，接种AMF的植物一般会比不接种植物生长得更好[31]，菌根苗在盐胁迫下比非菌根苗有更高的地上部和地下部生物量[32]，这与AMF根外菌丝扩大宿主植物根系的营养和水分吸收范围高度相关[33]。本研究中，盐胁迫下接种AMF对榉树生长的影响主要体现在提升地径净增长量方面，这可能是因为盐胁迫下离子渗透及胁迫严重，根系汲水汲养困难，AMF主要通过改善植物根系形态，促进地下根系生长[34]，提高植物在盐胁迫下的生产力。

菌根侵染率是反映AMF侵染植物情况的重要指标[35]，其取决于AMF菌种和寄主植物物种组合[36-37]，本研究中，无论胁迫与否，GM1对榉树根系侵染率均显著高于接种GO，这也证实了上述结论。此外，前人研究认为盐胁迫会降低AMF对寄主植物的侵染率[38]，本研究也显示盐胁迫对GM1和GO处理的菌根侵染率均有显著降低作用，这可能是由于盐分抑制了AMF菌丝生长、产孢和孢子的萌发[39]。然而，本研究中GM2处理的菌根侵染率并未受到盐胁迫的显著影响，一方面可能是AMF菌株的盐耐受性差异导致[40]，另一方面可能与AMF菌种和寄主植物的亲和力有关[41]。

盐分过量地进入植物叶片会损害光合结构，减少叶片光合色素含量，进而导致植物生长变慢、生物量积累下降[42]。而接种AMF被认为能够通过提高叶片气孔交换能力、光合色素含量、光合系统PSⅡ的光化学和非光化学作用，进而增强植物光合作用[43-44]。本研究中，盐胁迫大幅度降低榉树净光合速率，并伴随着胞间CO2浓度的下降，气孔限制明显，可能是由于盐胁迫导致叶片气孔关闭，叶肉细胞胞间CO2的消耗速率大于供应速率，从而造成胞间CO2浓度的降低，这与前人的研究结果相一致[45]。此外，本研究结果显示，盐胁迫下接种AMF降低了榉树叶片胞间CO2浓度，并伴有气孔限制值的增加，这可能是过高的土壤盐分对榉树叶片气孔生理损伤严重，光合作用气孔限制明显，超过了AMF对气孔导度的调节能力。然而，尽管胞间CO2浓度降低，气孔限制值增加，盐胁迫下接种AMF却使榉树获得了更高的净光合速率，这可能是接种AMF有效提升了植物体CO2同化率，进而促进单位光合速率[46]。水分利用效率是反映植物物质积累与耗水量之间关系的重要生理生态参数，可用于估算环境因素对植物的影响[47-48]。本研究中水分利用效率均随光合有效辐射的增加呈现先上升后下降趋势。此外，接种AMF均有效提升了盐胁迫下榉树叶片的水分利用效率，这可能是AMF通过增加植物体侧根数量[49]、调节水势[50]和根外菌丝汲水，有效改善了植株的水分利用情况。

光响应曲线模型能反映出光合速率与光合有效辐射的关系，然而不同植物最适用的光响应曲线模型不同[51]。笔者研究发现盐胁迫下叶子飘模型对榉树光响应曲线的拟合效果最好，R2的均值达到0.953，而其余模型R2均低于0.900，拟合效果较差。前人研究发现直角双曲线模型、非直角双曲线模型、指数模型都是没有极值的函数，无法直接获得植物的最大净光合速率和饱和光强等指标，而这一问题在叶子飘模型下得到了解决[52-53]。因而，在盐胁迫及接种AMF条件下，应用光响应模型时，应该以叶子飘模型为主，这将有助于利用诸如暗呼吸速率、光饱和点、光补偿点等特征参数直接或间接反映榉树的光合生理过程，对研究榉树盐碱地生态适应性具有重要意义。

综上，本研究结果表明盐胁迫对植物生长及光合特性有抑制作用；接种AMF可以促进植物生长，提升植物叶片净光合速率，缓解盐胁迫对植物生长及光合特性的抑制作用；综合AMF对榉树生长，光合特性的影响，GM2较为突出，为盐碱地林业生产推荐选用菌株；5种光响应模型拟合中，叶子飘模型的拟合效果最好，为探究盐胁迫下AMF对榉树净光合速率影响的最优模型。