杉木ClWRKY44基因克隆及其表达特性分析

林莉莉，胡安琪，陈 钢,3，张霁月，曹光球,3，曹世江,3*

(1.福建农林大学林学院，福建 福州 350002；2.华川技术有限公司，福建 福州 350008；3.国家林业和草原局杉木工程技术研究中心，福建 福州 350002)

杉木(Cunninghamialanceolata)是我国主要的速生造林树种之一[1-3]。杉木的用途广泛、市场需求量大，为满足目前市场对木材的需求，提高杉木速生、丰产性能，以及杉木抗旱和抗逆能力尤为重要。

在多种植物中都发现了参与响应非生物和生物胁迫的WRKY基因，有的WRKY基因还参与了多种胁迫应答[4-5]。从已发表的研究结果来看，WRKY家族的大部分成员在高盐、干旱和病害胁迫中倾向于上调表达，这可以从WRKY基因的诱导或过表达实验中得到证实。有研究表明，棉花(Gossypiumspp.)中WRKYs受盐离子胁迫时表达增加[6]。在低磷胁迫下，ClWRKY8、ClWRKY21、ClWRKY24、ClWRKY35这4个基因可能参与杉木耐受低磷胁迫的调控过程[7]。在木薯(Manihotesculenta)中鉴定了82个家族成员，其中MeWRKY11和MeWRKY14对干旱胁迫表现出极强的特异响应，MeWRKY18表现出对盐的特异响应，同时MeWRKYs对渗透压、脱落酸、冷害和双氧水也有响应[4]。WRKY是一类植物特有的转录因子，它不仅是应对非生物胁迫的重要转录因子之一，也是植物信号传递网络的重要组成部分，参与调控植物的生长过程[8]，WRKY转录因子在植物体内起到重要的生物功能作用，其中包括调节种子的萌发、开花期和叶片衰落等[9]。

WRKY基因具有保守结构域，其中包含有1个植物中独有的转录因子家族,WRKYGQK序列[10]。Ishiguro等[11]首次克隆出WRKY蛋白SPF1，随后学者在挪威云杉(Piceaabies)中克隆出了50个WRKY基因、从北美黄杉(Pseudotsugamenziesii)中发现了80个WRKY基因[12]。因杉木的全基因组尚未获得，使WRKY基因难以鉴定，但WRKY蛋白质具有高度保守的氨基酸序列WRKYGQK。根据测序已完成的模式植物拟南芥全基因组序列，利用高度保守的氨基酸序列WRKYGQK搜索拟南芥基因组编码序列，结果表明，拟南芥具有74个WRKY基因。因为克隆的杉木WRKY基因与拟南芥WRKY44基因相似，所以将该基因命名为ClWRKY44基因。本研究以杉木WRKY基因为研究对象，运用RT-PCR技术以杉木嫩叶的cDNA为模板克隆杉木ClWRKY44转录因子，杉木的不同组织和其在不同非生物逆境胁迫处理下，利用实时荧光定量技术分析杉木ClWRKY44基因的表达特性，为后续开展调控杉木抗逆性的分子机制研究和进行杉木抗逆性的遗传改良提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验材料来源于福建省漳平市五一国有林场(117°29′E，25°02′N)的杉木1.5代种子园。于2018年12月种子成熟季节，收集饱满、品质好的杉木种子，放置于4 ℃冰箱保存；菌株分别是大肠杆菌JM109G和DH5α；连接载体分别为pMD18-T和PENTR，其抗性标记为卡那霉素(Kna)和氨苄青霉素(Amp)。

1.2 试验设计

于2018年12月开始试验，杉木种子萌发实验方法如下：①将成熟的杉木种子用0.1%(质量分数)KMnO4溶液消毒3 h，去除空瘪粒种子；②用灭菌水冲洗以彻底去掉残留的KMnO4；③将种子放入45 ℃温水(室温自然冷却)中浸泡24 h；④挑选饱满的种子放入灭菌带滤纸的培养皿中，摆放均匀，加水浸湿滤纸；⑤将培养皿放到光照培养箱中培养，12 h 25 ℃ 光/12 h 20 ℃暗，相对湿度为75%；⑥随时观察，去除发霉种子。

杉木种子萌发20 d后，将已萌发的杉木苗分别置于4 ℃和35 ℃光照培养箱中培养处理，杉木幼苗生长发育0、6、12、24、48 h时分别取其嫩叶为材料，0 h为对照，置于-80 ℃冰箱备用。取新的杉木种子萌发20 d后，配制5%(质量分数)聚乙二醇(PEG)低浓度和25% PEG高浓度的溶液,分别加入已有萌发的杉木种子苗的培养皿中,放到同光照培养箱中培养。在5% PEG(低浓度)和25%PEG(高浓度)的溶液下处理，杉木幼苗生长发育0、6、12、24、48 h时分别取嫩叶为材料(0 h为对照)，置于-80 ℃冰箱备用。每个处理杉木幼苗6株，以保证生物学重复。

1.3 测定方法

1.3.1 杉木ClWRKY44基因克隆与实时荧光定量聚合酶链式反应

从NCBI的Gen Bank 数据库查询杉木的目标基因DNA 序列进行特异引物设计(表1)。采用TIANScript cDNA第1链合成试剂盒(天根生化科技有限公司，北京)对检测合格的杉木总RNA模板进行逆转录第1链cDNA的合成，随后把合成的cDNA稀释10倍后再进行聚合酶链式反应(PCR)。PCR反应程序为：先94 ℃预变性 3 min；然后98 ℃变性30 s，55 ℃下退火30 s，68 ℃延伸1 min，共32循环；最后68 ℃再延伸7 min。将扩增产物经1%(质量分数)琼脂糖凝胶电泳检测后，通过高效连接液Solution1连接到pDM18-T载体上。在微量离心管中加0.5 μL pDM18-T载体，1 μL PCR产物，1 μL DEPC水, 加2.5 μL(等量)的Solution1。在16 ℃下反应1 h，全量(5 μL)加入至JM109G感受态细胞中，冰中放置30 min。42 ℃加热45 s后，再放冰上2 min，加入895 μL Soc培养基，37 ℃摇床培养1 h，进行Amp抗性筛选。在次日随机挑选阳性克隆进行摇菌，然后对其提取质粒并通过PCR检测验证，检测结果正确后再进行测序，即是高效克隆载体PMD18-T-ClWRKY44。利用实时荧光定量聚合酶链式反应(q-PCR)来检测ClWRKY44基因在不同组织的表达情况。实时荧光定量聚合酶链式反应的扩增试剂和荧光染料分别是SYBR Premix ExTaq和SYBR GreenⅠ(全式金生物技术有限公司，北京)，杉木的内参基因是Actin基因[13]，先用普通PCR检测体系的反应条件(退火温度、模板量等)进行扩增反应，并将PCR产物进行测序，以保证q-PCR结果的准确性。通过内参基因进行归一化比较，根据目的基因杉木ClWRKY44和杉木内参基因标准品的拷贝数与其相对应的循环阈值(cycles threshold，CT)，利用实时定量PCR和2-△△CT法[14]分析杉木ClWRKY44目的基因相对表达量。

表1 杉木ClWRKY44基因克隆及 q-PCR 反应中所用引物序列

1.3.2 ClWRKY44的生物信息学分析方法

将克隆ClWRKY44基因的PCR产物送至福州铂尚生物工程技术有限公司进行测序，并用ClWRKY44基因的cDNA序列推导出其蛋白质序列。采用Phytozome V13(https://phytozome-next.jgi.doe.gov/)的Blast对测序结果进行同源性比对，并运用DNAMAN V9.0软件对ClWRKY44基因的cDNA序列进行分析，推测得到其蛋白质编码氨基酸序列，利用 TMHMM Server V.2.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)在线进行其蛋白质跨膜区预测。利用NCBI找出ClWRKY蛋白序列相近的其他物种的同源序列，并使用MEGA 6.0[15]中邻位相连法构建系统发育进化树。

1.3.3 ClWRKY44蛋白的亚细胞定位

将其PCR产物切胶回收，通过Gateway系统把ClWRKY44基因转入pENTR载体和DH5α 大肠杆菌感受态细胞中，通过卡那霉素(50 mg/L)筛选后，挑取其12个单克隆摇菌并进行菌落PCR检验，选择结果为阳性克隆且符合基因片段大小，可将其菌液提取质粒作为入门载体。通过Gateway技术的LR反应将ClWRKY44基因的融合产物插入到植物表达载体pGWB605上，转化LR反应产物到大肠杆菌DH5α，从转化的平板上挑取单克隆菌落经壮观霉素筛选进行菌落PCR验证，挑取阳性菌落并摇菌提取质粒作为表达载体。运用冻融法将其质粒转入农杆菌GV3101感受态细胞中，进行PCR鉴定出阳性菌落，在对应抗生素的LB液体培养基中加入阳性菌落进行震荡培养过夜。将农杆菌离心(4 000 r/min)20 min，去掉上清液，并将配置好的侵染液按比例调整菌液OD值为0.6～1.0；使用1 mL注射器将菌液缓慢渗透注射到烟草叶背面的叶片组织间隙中，在25 ℃条件下培养36～48 h后，取被侵染菌液的烟草叶片放在激光共聚焦显微镜(Leica TCS SP8x)下观察，同时使用mCherry红色荧光标记内质网[16]。

2 结果与分析

2.1 ClWRKY44基因克隆

利用引物WRKY44-Fw和WRKY44-Rv，以杉木嫩叶的cDNA为模板进行PCR反应得到目的基因，通过1%(质量分数)琼脂糖凝胶电泳，结果显示，该目的基因ClWRKY44的长度为1 776 bp，与预期目的基因ClWRKY44的长度相符(图1)。

1、2.ClWRKY44 PCR产物product;M.marker.

2.2 ClWRKY44的生物信息学分析

2.2.1 ClWRKY44蛋白基本性质

杉木ClWRKY44使用ExPASy-ProtParam tool(https://web.expasy.org/protparam/)在线分析蛋白基本理化性质，推测杉木ClWRKY44蛋白的相对分子质量和理论等电点(IP)值分别为64 956.79和8.75，其正电荷残基数和负电荷残基数为80和73；该蛋白的理论推导半衰期为30 h，不稳定系数是51.09，其理论上脂肪系数是55.25且总平均亲水性为-0.870，说明杉木ClWRKY属于不稳定蛋白。运用在线预测程序TMHMM对ClWRKY蛋白进行蛋白跨膜结构分析，从结果(图2)可以看出，ClWRKY序列中没有跨膜结构。

图2 ClWRKY44基因的蛋白质跨膜结构

2.2.2 ClWRKY44蛋白氨基酸序列的疏水性

利用ExPASy-ProtScale(https://web.expasy.org/protscale/)在线分析预测ClWRKY44蛋白氨基酸序列的亲水性/疏水性，当数值为负时，氨基酸为亲水氨基酸；当数值为正时，氨基酸为疏水氨基酸，且数值的绝对值越大，亲/疏水性越强。分析结果(图3)可知，该编码蛋白内亲水性氨基酸多于疏水性氨基酸，在第4位处为正值最大值1.76，在第400位处为负值最小值(-3.69)，且疏水性氨基酸多分布在肽链的N-末端，亲水性氨基酸多分布在肽链的C-末端。整体而言，ClWRKY44蛋白总疏水性为-503，由此推测该蛋白属于亲水性蛋白。

图3 ClWRKY44蛋白氨基酸序列的疏水性分析

2.2.3 多序列对比

利用DNAMAN程序将ClWRKY蛋白序列与其他已知植物的蛋白序列进行同源比对分析，结果(图4)发现,ClWRKY44基因编码蛋白与拟南芥(ArabidopsisthalianaTAIR10，At)、毛果杨(Populustrichocarpav3.0，Pt)、菠萝(AnanascomosusV3.1，Aco)、水稻(Oryzasativav7_JGI，Os)基因的蛋白保守结构域一样，都具有典型的第一类WRKY转录因子的特征，包括两个WRKY结构域(WRKYGQK)和锌指结构[HCX7CX23HXC(C2HC)],所以ClWRKY44编码蛋白与水稻、拟南芥、菠萝、毛果杨蛋白具有较高的同源性，可归为一个小的类群，且它们都属于WRKY转录因子家族第Ⅰ类成员(图4)。

图4 ClWRKY44基因与水稻、拟南芥、菠萝和毛果杨蛋白的保守结构

2.2.4 ClWRKY44蛋白同源比对与进化树的构建

运用 MEGA 6.0软件对杉木ClWRKY44构建系统进化树，将克隆到的ClWRKY44蛋白序列在Genbank中进行Blast比对，结果(图5)表明，其与拟南芥、菠萝、水稻、毛果杨4个物种中的17个WRKY蛋白序列相近，聚类分析并构建系统进化树的结果显示，ClWRKY44与拟南芥的ATWRKY44蛋白序列同源性为99%，两者分布在一个小分支上，说明它们的亲缘关系比较近，且同源性比较高，可能它们执行的功能类似。此外，由于本试验所克隆出的WRKY基因的编码蛋白与ATWRKY44蛋白亲缘关系为99%，故将此基因命名为ClWRKY44(图 5)。

图5 ClWRKY44系统进化树

2.3 杉木ClWRKY44基因的表达分析

为了研究ClWRKY44在杉木中是否具有组织特异性表达，对杉木ClWRKY44基因在不同器官中的表达情况进行分析,结果(图6)表明，杉木的根(R)、茎(S)、叶(L)3个器官均有WRKY44基因表达，且ClWRKY44基因在杉木叶中的相对表达量最高，茎中次之，在根中的相对表达量最低。可以推测ClWRKY44基因与杉木木材生长发育的调控有密切关系。

*.P<0.05; **.P<0.01。下同。The same below.

2.4 杉木ClWRKY44蛋白在烟草中的亚细胞定位分析

采用农杆菌介导法将构建好的杉木ClWRKY44基因载体导入烟草表皮细胞中，并在激光共聚焦显微镜(Leica TCS SP8X)下观察。结果(图7)显示，其烟草含有转化重组载体pGWB-35S-ClWRKY44-GFP的表皮细胞可以在细胞核中检测到荧光，说明目的基因ClWRKY44主要定位在细胞核上。

a.具有 DYPI 标签的细胞核marker nuclear marker with DYPI label；b.具有 GFP标签的ClWRKY44基因ClWRKY44 gene with GFP label；c.明场bright field；d.3图叠加的效果the three-picture superimposed effect.

2.5 不同胁迫处理下ClWRKY44 基因相对表达量分析

未经处理萌发20 d后的幼苗,以及分别经过4 ℃低温处理48 h、35 ℃高温处理48 h、5%(质量分数)PEG低浓度干旱处理48 h、25%PEG高浓度干旱处理48 h的幼苗，其ClWRKY44基因相对表达量呈现不同程度的变化(图8)。

对低温处理过的幼苗的ClWRKY44基因相对表达结果分析表明，该基因在苗木耐低温性中起到重要作用。从图8a可知，与对照组相比，胁迫处理6 h 时，ClWRKY44基因在低温胁迫处理的相对表达量最高，约是对照空白组的79.8倍；随着低温胁迫时间的延长，ClWRKY44基因的相对表达量显现出下降的趋势；当低温胁迫时间达到 48 h 时，相对表达量仍高于对照，是对照组的5.6倍。

图8 不同胁迫下杉木ClWRKY44 基因相对表达量

对高温胁迫处理下杉木幼苗的ClWRKY44基因相对表达结果(图8b)分析可知，与对照空白组相比，该基因在高温胁迫处理的相对表达量低于对照空白组，且随着高温胁迫时间的延长，ClWRKY44基因的相对表达量显现出逐渐下降的趋势；当高温胁迫时间达到48 h时，ClWRKY44的相对表达量最小，说明ClWRKY44基因在低温胁迫中起到调控的作用，在高温胁迫中的调控作用不明显。

ClWRKY44基因在低浓度干旱胁迫处理下杉木幼苗的相对表达结果(图8c)表明，低浓度干旱胁迫处理24 h时，ClWRKY44基因的相对表达量比对照组略高。总体而言，ClWRKY44基因在低浓度干旱胁迫处理的相对表达量大多低于对照组，说明ClWRKY44基因对于低浓度干旱胁迫处理的响应不明显。

ClWRKY44基因在高浓度干旱胁迫处理下杉木幼苗的相对表达结果(图8d)显示，与对照相比，高浓度干旱胁迫处理短时间(6 h)的ClWRKY44基因相对表达量约是对照组的32.9倍;当时间延长(12 h)时，ClWRKY44基因在高浓度干旱胁迫处理下的相对表达量最高，且约是对照组的46.6倍。随着高浓度干旱胁迫时间的延长，ClWRKY44基因的相对表达量呈现出下调的趋势，但直到胁迫时间达到48 h时，其仍高于对照空白组处理，是对照空白组的5.6倍。说明ClWRKY44基因在低浓度干旱胁迫中调控作用明显有限，但是在高浓度干旱胁迫中能起到调控作用。

3 讨 论

植物在干旱、低温、高温等极端条件下生长发育的过程中，自身形成了一套高效且有序的反应机制，是为了保护植物在生长发育过程中免受各种各样的胁迫。这种有效的反应机制过程的有序进行需要不同的转录因子和信号转导途径来共同完成。随着各种基因组学技术的发展，转录因子已成为植物基因功能研究的重点之一，目前为止，WRKY转录因子已在多个物种中得到挖掘、鉴定与功能分析。WRKY转录因子在生物胁迫应答方面和非生物胁迫(冻害、干旱和盐害等)应答方面都具有重要的功能[17]。有研究表明,水稻和拟南芥受到极限温度和干旱等非生物胁迫时会诱导WRKY基因表达，从而说明在调控植物逆境胁迫应答过程中WRKY转录因子可以发挥调控功能[1]。Northern 杂交分析表明,10/13OsWRKY基因分别对NaCl、聚乙二醇(PEG)或冷热处理都能产生应答[18]。已有不少研究发现WRKY转录因子参与应对各种生物胁迫与非生物胁迫，例如低温胁迫、盐胁迫和干旱胁迫等。有研究表明，过表达的转ZmWRKY106基因玉米(Zeamays)植株提高了对干旱和高温胁迫的耐受性[19]，水稻OsWRKY71在应对冷害胁迫中起重要调控作用[6]，小麦(Triticumaestivum)TaWRKY44受干旱和低温胁迫诱导表达[20]。同时有研究表明，WRKY 转录因子不仅参与植物对非生物胁迫的应答，还参与调控植物的激素信号通路以及生长发育,但关于杉木WRKY基因的研究相对较少。

本研究克隆的杉木ClWRKY44基因编码的蛋白质序列与拟南芥ATWRKY44的同源性很高，且都包含两个WRKY结构域与1个锌指结构，都可归为第Ⅰ类WRKY转录因子。系统进化树分析表明该基因与ATWRKY44第Ⅰ类WRKY成员关系亲近，且它与ATWRKY44的相似性为99%，将其命名为ClWRKY44。ClWRKY44在植物不同器官中的表达量不同，其在叶中高度表达，可以推测出ClWRKY44基因响应杉木嫩叶诱导表达。植物中除了ClWRKY44基因，还有类似WRKY基因家族，水稻、拟南芥、菠萝、毛杨果在基因序列上具有部分同源，说明ClWRKY44基因可以有类似的基因功能。

采用实时荧光定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)分析ClWRKY44基因对极限温度和干旱等非生物胁迫因子的诱导表达，结果显示，4℃低温胁迫处理6 h,杉木ClWRKY44基因相对表达量最高，杉木种子芽在25%PEG高浓度干旱胁迫处理24 h时，ClWRKY44基因的相对表达量最高。前人研究发现，WRKY转录因子的上游调节基因和下游靶基因之间存在相互作用，拟南芥中的GI基因和miRNA172可以调控ATWRKY44基因表达，且可以进行互作形成GI-miRNA172-WRKY44，其可能是通过糖信号通路来调控拟南芥对干旱逆境的响应[21]，水曲柳(Fraxinusmandshurica)FmWRKY44基因积极响应低温、高温胁迫[22]。水曲柳和拟南芥在受到极限温度和干旱等非生物胁迫时，会诱导其WRKY转录因子表达，说明WRKY转录因子在调控植物逆境胁迫应答过程中可以发挥功能。本研究中发现杉木ClWRKY44基因在低温胁迫中起到调控作用，且在高浓度干旱胁迫中也能起到调控的作用，此结果为杉木幼苗生长发育的生态适应性提供理论参考。