南京地区美洲黑杨雌、雄花芽分化的解剖学研究

陆 静，陈文文，吴怀通，陈赢男

(南京林业大学林木遗传与生物技术省部共建教育部重点实验室，南京林业大学林学院，南方现代林业协同创新中心，江苏 南京 210037)

成花是植物生长发育过程中的重要转折，是一个复杂的生物学过程，受到多种植物内源和外界环境信号的共同调控。基于拟南芥(Arabidopsisthaliana)、金鱼草(Antirrhinummajus)等草本模式植物的研究结果，目前公认的成花调控途径主要包括：春化途径、光周期途径、赤霉素途径、环境温度途径、年龄途径和自主途径[1]。此外，分子生物学技术的快速发展促使越来越多花分生组织和花器官发育特征基因被分离鉴定。如花分生组织特征基因LFY(LEAFY)、AP1(APETALA1)、FUL(FRUITFUL)、CAL(CAULIFLOWER)等可以调控花序分生组织转变为花分生组织，决定花器官起始和发育[2-4]；B类功能基因AP3(APETALA3)调控花瓣和雄蕊的发育[5]；C类功能基因AG(AGAMOUS)决定雌蕊和雄蕊形成[6]。关于木本植物成花机理的研究起步较晚，尽管研究者发现一些开花调控分子路径在不同植物中存在保守性，如光周期途径中CO-FT调控植物响应日长、昼夜节律变化，并对休眠具有重要调节功能[7]；年龄途径中miR156/miR172调控童期向成年期转变[8]，但总体看对木本植物成花调控分子机制的认识还十分有限。与草本植物不同，木本植物大多需经历较长的童期才能成花，且花器官分化延续时间较长。人们一方面希望培育早花品系，缩短童期，加快育种进程；另一方面希望能够延迟开花，调节光合产物分配，以提高木材产量、改良木材品质。因此，研究木本植物花芽分化进程和特点，阐明花芽分化过程中外部形态与内部解剖结构的相关性，对于揭示树木成花的分子调控机制具有重要意义。

美洲黑杨(Populusdeltoides)属杨柳科杨属(Populus)黑杨派，原产北美洲东部和中部地区，具有树干通直、生长迅速、材质优良等特点[9]。自20世纪70年代引种以来，经过40多年的大规模栽培实践，美洲黑杨已成为我国重要的速生用材和造林树种之一。同时，美洲黑杨也是人工杂交亲本的主要来源[10]，如利用美洲黑杨与欧美杨(Populus×canadensis)杂交，从子代群体中选育出来的‘南林895杨’被收入国家林业和草原局首批林木良种名录，适于在黄淮、江淮及长江中下游平原地区推广种植[11]。本研究利用石蜡切片技术，对不同发育时期的美洲黑杨雌、雄花器官进行观察研究，以期明确美洲黑杨花芽分化时间，系统分析不同性别花器官发育关键阶段和相应特征，为进一步深入研究杨树花器官发育及性别分化的分子机制奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

以栽植于南京林业大学校园内的成年美洲黑杨为试验材料，树高约20 m，冠幅5～6 m，树冠四周受光均匀，长势良好，无病虫害。于2018年6—10月，每隔15 d采集1次雌、雄花芽；2018年11月至2019年3月，每隔30 d采集1次雌、雄花芽，共计采样15次(编号T1—T15)。样品编号与采样时间的对应关系见表1。

表1 采样时间与样品编号

1.2 试验方法

观察不同生长阶段美洲黑杨雌、雄花芽外部形态特征并测量其长度，每时期7个生物学重复。将花芽浸泡于FAA固定液(体积分数为70%的乙醇溶液90 mL，冰醋酸、体积分数为38%的甲醛和丙三醇各5 mL)，固定24 h以上。T11—T15时期的样品，用手术刀去除花芽外部鳞片后再进行固定。石蜡切片制作参考付盼等[12]的方法，包括：乙醇梯度脱水(体积分数75%、85%、95%乙醇溶液，每梯度脱水各40 min；无水乙醇处理第1次20 min，第2次10 min)、透明处理(无水乙醇与二甲苯体积比 1∶1混合液静置20 min，后转入二甲苯溶液2次，依次为15 min和10 min)、浸蜡包埋(熔点为58～60 ℃)、切片(厚度8～10 μm)、烘片、脱蜡复水，并用番红-固绿双重染色法染色，封片烘干。将制作好的切片在Axio Imager 2型光学显微镜(ZEISS)下观察并拍照记录。

2 结果与分析

2.1 美洲黑杨雌、雄花芽外观形态特征

在南京地区，每年成年美洲黑杨的花芽形态分化始于5月底至6月初，6月中旬至7月中旬(T2—T4)雌花和雄花原基则出现明显形态学差异，雄花原基普遍较雌花原基大而饱满。无论是雌花芽还是雄花芽，苞片在每个生长阶段都保持外观嫩绿、质地坚硬、保留2道芽鳞痕(图1A)。对不同生长阶段美洲黑杨雌、雄花芽纵向长度进行统计分析，结果显示：花芽的生长趋势呈“S”形(sigmoid)。表现为当年6月初至10月初(T1—T9)，花芽长度增幅较大；10月末开始至次年1月(T10—T13)，生长速度增加缓慢，开始进入休眠期；次年2月至3月(T14—T15)，花芽逐渐解除休眠，恢复生长，在T15阶段迅猛增长，越发膨大，部分花芽的芽鳞出现明显松动直至完全开花(图1B)。

A.雌、雄花芽外观形态对比comparison of appearance and morphology of male and female floral buds；B.雌、雄花芽生长曲线growth curves of male and female floral buds。**.同一时期雌、雄花芽长度存在极显著差异(P<0.01)。** refered a extremely significant difference in floral bud length between female and male plants at the same stage(P<0.01).

2.2 美洲黑杨雌、雄花芽解剖结构特征

为进一步研究美洲黑杨雌、雄花芽形态分化的基本规律，利用石蜡切片技术，对比分析了不同时期雌、雄花芽的解剖结构，并将所观察到的美洲黑杨花芽发育过程分为5个阶段(Stage Ⅰ-Stage Ⅴ，表2)。

表2 美洲黑杨雌、雄花芽发育阶段

苞片分化期(Stage Ⅰ)：鳞片包裹内的雌、雄花序原基外形均呈圆锥形，生长点顶端表面趋于平坦，并在侧面首先分化形成苞片；在6月初，雄花芽长度和宽度均已大于雌花芽，且从苞片的分化和伸长情况来看，雄花序原基较早开始分化。随着苞片的不断伸长，花序呈现向顶分化，进入小花原基起始期(Stage Ⅱ)：苞片腋部细胞逐渐分化形成盘状花原基，随后其边缘细胞不断膨大形成突起的组织环；同时，位于雌花芽顶端中央的细胞不断扩张，呈球形凸起(图2，T3♀、T4♀)，而此时雄花芽顶端中央的细胞分化较慢，呈凹陷状(图2，T2♂)。

雌蕊分化期(Stage Ⅲ)：花原基四周形成的突起组织环继续增大，最终形成杯状花被(图2，T8♀)；9月末，小花顶端出现明显的二分叉状结构(图2，T8♀)，子房已具雏形；11月中旬，形成具有柱头、花柱和子房的完整雌蕊，即单性雌花(无花瓣结构)，柱头四分裂，子房单室，含2～4心皮，侧膜胎座。根据Boes等[13]对毛果杨(P.trichocarpa)雌花芽的解剖观察，孢原细胞的发生也在这个时期开始。此后，雌蕊发育停滞，进入冬季休眠期。第2年春季孢原细胞体积增大，分裂形成大孢子母细胞，伴随鳞芽松动，大孢子母细胞进一步分化形成大孢子和胚囊，胚珠倒生(Stage V)。至此，雌花发育成熟，每朵小花下有膜状杯形花被(图2,T13♀)。

雄蕊分化期(Stage Ⅲ)：7月初，在圆盘状凹陷的分生区内出现很多圆形凸起，即雄蕊原基(图2，T3♂)；9月下旬，花盘内已形成较为明显的花药结构(图2，T8♂)，花药进一步发育成蝶形花粉囊，可见4个花粉囊室，每个花粉囊室内已分化出大量的小孢子母细胞(图2，T12♂、T13♂)，此后雄花芽进入休眠。第2年春季，小孢子囊最内层细胞发育成绒毡层，小孢子母细胞减数分裂，经四分体时期最终形成成熟花粉(Stage V)，花药表皮栓质化(图2，T15♂)，最终开裂促进传粉。辛昊阳等[14]对美洲黑杨小孢子母细胞减数分裂进程进行了详细观察，同样发现减数分裂始于3月中旬，在花序露出鳞片之前完成，但未明确指出美洲黑杨成熟花粉粒的类型。董源[15]曾报道毛白杨(P.tomentosa)的成熟花粉为二核花粉粒。而判断美洲黑杨成熟花粉粒的类型仍需对小孢子到花粉粒的发育过程进行持续观察。

图2 不同发育时期美洲黑杨雌、雄花芽解剖学观察

3 讨 论

开花是有花植物生长发育过程的重要转折点，植物的成花调控可以分为3个阶段：开花诱导(floral induction)、花的发端(floral evocation)和花器官发育(floral organ development)[16-17]。不同于草本模式植物拟南芥，杨树在完成童期向成年期转变后，每年1次的季节性开花都需经历上述3个阶段才能成花[18]。Yuceer等[19]通过对22 a树龄的成年美洲黑杨开展长期调查，提出了跨越3 a的开花周期：第1个生长季的5—9月枝条顶端形成鳞芽，鳞芽在冬季经历休眠和春化作用；第2个生长季的3—9月，由顶端鳞芽发育而成的当年生枝条由下向上可以分为3个区域，即营养区I(vegetative zone I)→开花区(floral zone)→营养区Ⅱ(vegetative zone Ⅱ)，只有位于开花区的腋芽经过成花诱导和花的发端才能发育为肉眼可见的花芽，完成花器官发育并在冬季再次经历休眠；第3个生长季的3—5月开花，完成传粉和受精过程。本研究在6月初所采集到的雌、雄花芽已经完成了成花诱导和花的发端，进入花器官发育阶段。雌、雄花芽在T1阶段虽然与营养芽形态相似，但并不是营养芽向生殖芽转变的过渡阶段，而是已经处于花器官分化初期。此外，不同于拟南芥的4轮完全花，美洲黑杨为柔荑花序，其花结构仅由苞片和雄蕊或雌蕊两轮结构组成，这种高度退化的花器官及紧密排列的花序结构可能是杨柳科植物趋同进化(convergent evolution)的结果，更有利于传粉和受精[20]。

杨属植物为雌雄异株(偶然存在雌雄同株的情况)，是研究植物性别决定遗传机制的理想材料之一。Mitchell等[21]根据花发育过程将单性花分为两种类型：Ⅰ型，在花发育过程中存在同时具备雌蕊和雄蕊的阶段，在发育完成之前某一性别的花器官发生败育，最终产生单性花；Ⅱ型，整个花发育过程仅出现一种性别的花器官。因此，在完成发育的Ⅰ型单性花中仍然可以看到残存的、不育的相反性别花器官，将具有这种单性花的雌雄异株植物称为隐性雌雄异株[22]，如柿子[23]、猕猴桃[24]等。本研究通过对美洲黑杨雌、雄花芽完整发育过程的解剖学观察，发现在雌或雄花芽苞片腋部发生的花器官原基仅发育成雌蕊或雄蕊，因此美洲黑杨雌花和雄花均为Ⅱ型单性花，其性别分化应该发生在心皮原基和雄蕊原基起始之前。研究花芽发育和分化规律，探究花芽外部形态与内部解剖结构之间的相关性，不仅为解析植物成花和花器官发育特征基因，揭示植物性别分化分子机制等前沿理论研究提供重要基础，还可为生产实践中优异种质资源的选育和管理等提供参考依据。例如，对不同品种大蒜(Alliumsativum)花芽分化进程进行解剖观察，明确了花芽分化时间与品种熟性的关系，对栽培过程中调控大蒜抽薹开花具有指导意义[25]；对刺槐(Robiniapseudoacacia)不同时期花蕾外部形态与雌雄配子发育特征的剖析可为花器官离体培养接种外植体的选择提供依据[26]；对青钱柳(Cyclocaryapaliurus)雌、雄花芽分化外部形态和内部发育进程相关性的研究可为选育优质青钱柳种质和选择栽培管理措施提供基础[27]；对麻疯树(Jatrophacurcas)花发育形态和解剖结构的研究可为人工增加麻疯树雌雄花比例、提高挂果率和种籽产量提供依据[28]。三倍体杨树具有速生、优质、抗病等优势，利用2n花粉进行杂交是培育三倍体杨树的重要途径[29]。辛昊阳等[14]详细记录了美洲黑杨小孢子母细胞的发生过程，为人工诱导2n配子的适时取材提供了参考。本研究对美洲黑杨雌、雄花芽发育关键时期开展了详细的观察和分析，将有助于指导杨树的人工授粉，提高杂交概率。