氮沉降和接种菌根真菌对灌木铁线莲非结构性碳水化合物及根际土壤酶活性的影响

张晓荣，段广德，郝龙飞*，刘婷岩，张 友，张盛晰

(1.内蒙古农业大学林学院，内蒙古 呼和浩特 010019；2.内蒙古自治区林业工作总站，内蒙古 呼和浩特 010020)

干旱半干旱区土壤自然含氮量较低，受农牧业发展的影响，大量氮素以沉降形式进入生态系统，一定程度缓解了该地区土壤氮素的限制，显著影响植物生长，同时也造成生态系统结构和功能的改变[1]。以往研究表明，氮沉降对植物的地上形态指标、根系形态结构、生物量分配比例以及光合生理过程等具有一定的影响[2]。过量的氮会导致植物光合速率下降、植物体内营养失衡、植物抗逆性(耐寒、抗旱、抗病虫害等)减弱以及森林生态系统多样性降低[3-4]。丛枝菌根真菌(arbuscular mycorrhizal fungi，AMF)可以与90%以上植物形成共生关系，帮助宿主植物吸收土壤中的矿质养分，提高植物对各种非生物胁迫的抵抗力[5]，同时植物将一部分碳水化合物作为交换供给AMF生长[6]。姜琦等[7]研究发现，外源氮输入使杉木(Cunninghamialanceolata)与AMF的共生关系更加密切，可促进植物吸收养分，增强植物对逆境适应能力。

非结构性碳水化合物(non-structure carbohydrate，NSC)既可以反映植物体内碳收支平衡状况，又体现植物对外界环境的抗逆性[8]。植物体内NSC含量的动态变化受温度、水分、CO2浓度和氮沉降等环境因子影响[9-10]；其中氮沉降显著影响土壤微生态环境，进而影响植物体内NSC含量[11]。土壤微生态环境变化影响植物根际理化性质、土壤微生物群落结构及养分转化相关酶活性[12]。马伟伟等[13]对高山林地土壤酶活性的研究发现，高浓度氮抑制β-D-葡萄糖苷酶、β-N-乙酰氨基葡糖苷酶和酸性磷酸酶活性，而对过氧化物酶和多酚氧化酶无显著影响。王凯等[14]研究发现，随着氮输入量的增加，杨树(Populusspp.)苗木细根中可溶性糖含量增加，而淀粉含量无显著差异。向芬等[15]研究发现适量的氮添加能提高植物叶片NSC含量和氮相关酶的活性。宰学明等[16]通过对菌根化滨梅(Prunusmaritima)苗木的研究发现，丛枝菌根能增加根际土壤酶的活性，改善苗木的微生态环境，从而提高根际土壤肥力。总结以往研究发现，关于根际土壤酶和NSC含量对氮沉降响应及菌根效应多为单一因素的响应研究，而二者交互作用的相关研究鲜见报道。

灌木铁线莲(Clematisfruticosa)是耐寒、耐旱的直立灌木，多分布于干旱的沙丘、荒漠等地区[17]，对于维护干旱沙漠地区生态系统具有重要作用。本研究对比分析不同氮沉降水平下，1年生灌木铁线莲菌根苗与非菌根苗各器官非结构性碳水化合物分配和根际土壤酶活性的变化，旨在探讨菌根化灌木铁线莲调控植物NSC合成及根际土壤酶活性应对氮沉降胁迫的机制，以期为全球气候变化背景下探究植物生长策略与维持生态系统稳定性提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

灌木铁线莲种子采集于内蒙古呼和浩特市新城区水磨村(111.84°E，40.96°N)，属于典型的温带大陆性气候，年平均气温4.9 ℃，年平均降水量320～450 mm，土壤主要为栗褐土。

将供试种子用2%(质量分数)的KMnO4溶液消毒30 min，用去离子水洗净并播种。丛枝菌根真菌选择试验区优势菌根真菌摩西斗管囊霉(Funneliformismosseae)和根内根孢囊霉(Rhizophagusintraradices)作为菌种。两种AMF菌剂扩繁的寄主植物为紫花苜蓿(Medicagosativa)，扩繁基质为沙土(体积比为3∶1)混合物，最终的接种菌剂为扩繁基质、侵染根段、孢子和菌丝的混合物。施用的固体菌剂中孢子密度为18 700 个/kg。

1.2 试验方法

1.2.1 接菌处理

试验设置4个接菌处理，分别为：单一接菌[根内根孢囊霉(Rhizophagusintraradices)，编号+R；摩西斗管囊霉(Funneliformismosseae)，编号+F]、混合接菌(根内根孢囊霉和摩西斗管囊霉体积比1∶1的混合菌剂，编号+RF)和未接菌处理(未接菌，编号-M)。2019年10月，在育苗盆(直径为15 cm)中放入高温高压灭菌基质(土与蛭石体积比为2∶1)至盆高4/5处，然后在灭菌基质上平铺等量混匀的30.0 g固体菌剂。对照处理中施等量固体灭菌基质，消毒后的灌木铁线莲种子播入其中，其上再用灭菌基质覆盖。保证苗木生长的根系与菌剂充分接触，每盆质量控制1.0 kg；浇透水后，置于内蒙古农业大学人工气候室(温度20～25 ℃，相对湿度40%～60%，最大光照度10 000 lx)培养，每盆保留3株苗木。

1.2.2 模拟氮沉降处理

1.3 根际土壤酶测定

模拟氮沉降处理结束15 d后，通过抖落法取下植物根际土壤。土壤酶活性的测定包括土壤碳相关酶[β-1，4葡萄糖苷酶(BG)]、土壤氮相关酶[亮氨酸氨基肽酶(LAP)和β-1，4-N-乙酰-氨基葡糖苷酶(NAG)]、土壤磷相关酶[酸性磷酸酶(ACP)和碱性磷酸酶(ALP)]，具体测定参考Sinsabaugh等[20]的方法。BG、NAG、ACP酶的测定：称取0.25 g新鲜根际土壤，加入相应醋酸缓冲液配制的不同反应底物溶液4 mL，培养4 h后，提取2.5 mL上清液于试管中，加入NaOH终止反应和显色，使用UV-2800H紫外可见分光光度计(上海尤尼柯仪器有限公司)在410 nm处测定吸光度。LAP和ALP的测定方法稍有不同，即：称取0.35和0.25 g新鲜土样后，分别采用Tris-羟甲基-氨基甲烷缓冲液和碳酸盐缓冲液配制相应底物溶液，其中LAP提取上清液后不加NaOH，测定吸光度，以对硝基苯酚的浓度表征酶活性[19]。

1.4 非结构性碳水化合物的提取及测定

土壤采样的同时，采用全株破坏性取样获取植物样品。每个处理取15株苗木，分成根、茎、叶3个部分。用去离子水清洗杂质并吸干表面水分后，编号装入封口袋内，用冷藏箱带回实验室。105 ℃杀青10 min，在75 ℃的烘箱内烘干至恒量，并将烘干的样品磨碎，过孔径为0.149 mm的筛子，装入黑暗密闭的容器内干燥保存，进行非结构性碳水化合物(NSC)的测定。NSC含量采用改进的苯酚-浓硫酸法测定，可溶性糖(SS)和淀粉(ST)含量的测定参照文献[21]。SS用80%(体积分数)乙醇溶液浸提，ST浓度加淀粉酶反应后过滤，分别取上清液与苯酚和浓硫酸反应，在490 nm波长处测定其吸光值。通过测定上清液葡萄糖浓度分别计算转换得到SS和ST含量。

1.5 数据处理

利用SPSS 23.0对接菌和氮沉降处理进行单因素方差分析和双因素交互作用分析，采用LSD多重比较法检验各处理苗木NSC和根际土壤酶活性的差异显著性(显著性水平为0.05)。采用Sigmaplot 10.0作图。

2 结果与分析

2.1 氮沉降及接菌处理对灌木铁线莲苗木根际土壤酶活性的影响

经测定发现，接种菌根真菌极显著影响灌木铁线莲苗木根际土壤酶活性(P<0.01)。氮沉降及二者交互作用显著影响亮氨酸氨基肽酶(LAP)、β-1，4-N-乙酰-氨基葡糖苷酶(NAG)、酸性磷酸酶(ACP)和碱性磷酸酶(ALP)活性(P<0.05)，而对β-1，4葡萄糖苷酶(BG)活性无显著影响(表1)。未接菌(-M)处理下，随氮沉降量递增，BG和LAP活性呈增加的趋势，NAG活性呈降低的趋势，与磷相关的根际土壤ACP和ALP活性在高氮(HN)条件下显著增加。在单一接种根内根孢囊霉(+R)和摩西斗管囊霉(+F)处理下，BG活性随着氮沉降量的递增无显著变化，LAP、NAG均在低氮(LN)条件下较大，而ALP在HN条件达到最大。与-M相比，单一接种摩西斗管囊霉(+F)和混合接种根内根孢囊霉和摩西斗管囊霉(+RF)处理下，各氮沉降处理的NAG活性显著下降。不施氮(CK)条件下，单一接菌和混合接菌显著增加BG、LAP和ALP活性，而NAG活性显著降低；CK条件下，-M与+RF处理相比，根际土壤酶BG、LAP、ACP、ALP活性分别降低了80.6%(P<0.05)、98.5%(P<0.05)、44.7%(P<0.05)、32.5%(P<0.05)，而NAG显著增加3 104.7%(P<0.05)。中氮(MN)条件下，-M处理根际土壤酶LAP活性较+R处理显著增加155.5%(P<0.05)，-M处理根际土壤酶ACP和ALP活性较+F处理分别显著降低61.0%(P<0.05)和38.3%(P<0.05)(表1)。

表1 氮沉降和接种菌根真菌对灌木铁线莲苗木根际土壤酶活性的影响

2.2 氮沉降及接菌处理对灌木铁线莲苗木非结构性碳水化合物含量的影响

氮沉降、接种菌根真菌及二者交互作用极显著影响灌木铁线莲苗木可溶性糖(SS)、淀粉(ST)和非结构性碳水化合物(NSC)的含量，且显著影响根、茎和叶中SS和NSC含量。氮沉降和接菌处理下，苗木体内SS、ST和NSC含量的变化趋势均相同，且苗木体内SS含量高于ST含量(图1)。不同氮沉降条件下，-M处理苗木各器官的SS、ST和NSC含量高低分布顺序为茎<根<叶。除CK条件外，各接菌处理的苗木ST含量在叶中最高，SS和NSC含量高低分布顺序为根<茎<叶。不同氮沉降条件下，所有接菌处理的苗木SS、ST和NSC含量明显高于未接菌处理，且在+F处理下苗木SS、ST和NSC含量均达到最大。+R和-M处理下，随着氮沉降水平的递增，SS、ST和NSC含量均呈先降低后增加的趋势；而+RF处理下，呈先增加后降低的趋势。在LN、MN、HN条件下，-M处理较+F处理的SS含量分别显著降低77.8%、81.9%和70.1%。在CK和HN条件下，-M处理相较于+F处理的ST含量分别显著降低63.5%和65.7%。HN条件下，+F处理苗木根内ST和NSC含量达到最大值，茎和叶内SS和NSC含量均达到最大值。LN条件下，+F处理苗木根内ST含量比叶显著降低58.7%(P<0.05)，根内NSC含量则比叶降低54.7%(P<0.05)。HN条件下，+F处理苗木根内SS含量比叶降低54.1%(P<0.05)(图1)。

不同大写字母表示同一接菌处理下各氮沉降水平间差异显著(P<0.05)；不同小写字母表示同一氮沉降水平下各接菌处理间差异显著(P<0.05)。Different capital letters indicated significant differences among different nitrogen deposition treatments under the same inoculation treatment(P<0.05)，different lowercase letters indicated significant differences among different inoculation treatments under the same nitrogen deposition treatment(P<0.05).

2.3 根际土壤酶活性和非结构性碳水化合物的相关性分析

不同氮沉降条件和接菌处理下苗木的SS、ST、NSC含量与根际土壤BG活性达到显著水平(P<0.05)，与LAP、NAG、ACP和ALP活性均达到了极显著水平(P<0.01)。在氮沉降和接种菌根真菌交互作用的影响下，SS、ST、NSC含量与根际土壤酶NAG活性呈极显著负相关(P<0.01)，与BG、LAP、ACP和ALP活性均呈显著正相关(P<0.05)。与磷相关的ALP活性和SS、ST、NSC含量的相关系数最高，与碳相关的BG活性和SS、ST、NSC含量的相关系数最低(表2)。

表2 灌木铁线莲苗木根际土壤酶活性与非结构性碳水化合物含量相关性分析

3 讨 论

3.1 接菌处理调控苗木根际土壤酶活性对氮沉降的响应

土壤微生物与植物根系通过分泌根际土壤酶影响根际微生态环境中矿质元素(碳、氮、磷)的转化和分解[22-23]。本研究结果显示，氮沉降、接种菌根真菌及两者交互作用显著影响土壤氮和磷养分循环相关酶，原因可能是氮沉降和接种菌根真菌增强植物矿质元素吸收和光合能力，导致根际土壤养分逐渐受限，进而土壤酶活性显著增强[24]。本研究也发现，在单一接菌处理下，与氮相关的两种酶活在低氮条件下较大，而与磷相关的ALP活性则在高氮条件下达到最大。该结果与以往关于不同施氮条件下高山林地土壤酶活性的研究结果存在差异[13]，其原因可能是接菌处理增加了植物的氮素吸收，而低氮条件下，土壤中直接可吸收利用的氮素相对不足，故与氮相关的酶活性优先增强；随着氮沉降量的递增，其酶活性逐渐下降；在高氮条件下，由于土壤有效氮含量的增加引起了磷供应相对不足，激发了磷酸酶的分泌，导致其活性增强[25]。随氮沉降量的递增，非菌根苗养分吸收低于菌根苗，低氮输入已基本满足苗木氮需求，土壤微生物减少氮获取酶的产生，故与氮相关的NAG活性降低，随着植物生长发育对营养元素的消耗，土壤对碳需求逐渐受限，进而导致土壤微生物产生碳相关的BG活性增加[19]。以上结果与以往关于资源配置理论解释土壤微生物及土壤酶活性对氮添加响应研究一致[26-27]。无外源氮输入条件下，除NAG酶外，菌根苗根际土壤酶活性高于非菌根苗，原因可能为菌根的形成改善了微生态环境，促进了植物对养分的吸收和利用，导致土壤微生物(细菌、真菌、放线菌)养分限制增强，进而促进了微生物酶的释放[28]。

3.2 接菌处理调控苗木非结构性碳水化合物对氮沉降的响应

非结构性碳水化合物(NSC)的含量大小反映植物对环境的适应策略[29]。接种菌根真菌提高了植物SS、ST和NSC积累量，这与以往研究结果一致[6]。原因为接菌处理增强了植物光合能力，一定范围的氮添加缓解了氮限制，进一步促进NSC的合成[30]。研究也发现，单一接种摩西斗管囊霉对植物NSC含量的影响最明显，说明摩西斗管囊霉较根内根孢囊酶耐氮性更强，在调控植物生长对氮沉降的响应中表现出一定的优势，最终导致了混合接菌中植物NSC含量居于两种单一接菌处理之间。不同氮沉降条件下，非菌根苗各器官SS、ST和NSC含量顺序为茎<根<叶，原因可能是叶作为光合作用主要器官，其NSC含量最高；其次植物将合成的NSC通过茎优先输送给根获取养分，剩余部分贮存在茎中促进其生长[31]。以上各器官NSC分配符合植物生长策略，也与张婉婷等[32]对氮添加处理后红砂(Reaumuriasoongarica)苗木NSC含量的研究结果相似。除无氮添加条件外，菌根苗各器官SS和NSC含量顺序为根<茎<叶，原因可能是菌根共生关系有效促进了植物养分吸收，苗木可溶性糖向根系运输相对减少，从而降低了根内可溶性糖含量。另外一个原因可能为接菌处理有效提高植物生长，最大限度地促进了植物地上生物量的积累，进而导致根系中的NSC相对下降。相关性分析发现，氮沉降和接菌处理下苗木NSC含量与根际土壤NAG活性呈显著负相关，与其余4种酶活性均呈显著正相关。原因可能是菌根共生关系与人工施入氮素增加了植物氮、磷吸收，促进了NSC合成，根际土壤养分减少导致相应土壤酶活性增强。而氮沉降处理向土壤中添加大量的氮元素，导致与氮相关的NAG活性下降[13]。研究发现，苗木NSC含量与磷相关的ALP活性的相关性最高，说明随氮沉降量递增，土壤磷逐渐成为限制植物生长的主要元素。苗木NSC含量与ACP活性的相关系数小于与ALP活性的相关性系数，原因可能是幼苗生长环境的pH偏碱性，故碱性磷酸酶活性在根际微生态系统中发挥主要作用。