UPLC-MS/MS测定海带中酰胺醇类药物残留

2022-11-28陈建南

食品工业 2022年11期

陈建南

福建中检华日食品安全检测有限公司（福州 350028）

酰胺醇类药物又称氯霉素类药物，其主要有氯霉素、甲砜霉素和氟苯尼考，主要治疗畜禽及水产动物细菌性疾病，因此被广泛用于畜禽和水产品养殖行业[1]。其中，氯霉素在使用过程会出现致命的灰婴综合征和再生障碍性贫血症[2-3]，因此被我国及其他一些国家和地区禁止使用。随着氯霉素的禁用，甲砜霉素和氟苯尼考成为在治疗水产动物细菌性疾病的主力军。海带不仅营养价值高且具有一定药用价值，是人们经常食用的植物，但是，它们可以吸收富集在周围环境的抗生素，因此为防止海带中的酰胺醇类药物对人体健康造成危害，建立海带中氯霉素残留量的有效检测方法显得尤为重要。

酰胺醇类药物的分析手段主要有气相色谱法、高效液相色谱法和高效液相色谱-串联质谱联用色谱法[4-9]。由于气相和液相色谱不仅灵敏度不够、定性能力差且前处理方法较繁琐，而高效液相色谱-串联质谱联用色谱法具有灵敏度较高、无需衍生化、检测时间短等特点。QuEChERS法[10-11]、固相萃取法[12]、加速溶剂萃取法[13]是酰胺醇类药物的前处理手段。固相萃取法步骤较繁琐，加速溶剂萃取法所用到仪器较贵且需要时间较长，而QuEChERS法操作具有简便、时间短、试剂用量少等特点。目前，关于酰胺醇类药物在海带中的残留分析尚未被报道。

试验采用QuEChERS-超高效液相色谱-串联质谱法，建立海带中的酰胺醇类药物残留分析方法。同时探究该方法中提取剂和净化剂对检测结果的影响，以期为海带中酰胺醇类药物残留量的检测提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

乙腈和甲醇（色谱纯，默克公司）；甲酸和乙酸（美国Fisher公司）；试验用水为超纯水；N-丙基乙二胺（PSA）、十八烷基键合硅胶（C18）和石墨化碳黑（GCB）：均为天津Agela公司；氯霉素、甲砜霉素和氟苯尼考（德国Dr.Ehrenstorfer公司）。

高效液相色谱-质谱联用仪、C18色谱柱（美国Agilent公司）；多管涡旋混匀仪（逗点生物技术有限公司）；Direct-Q3超纯水机（美国Millipore公司）；TDL-5C-PRP低高速离心机（上海安亭科学仪器厂），N-EVAP-12氮吹仪（美国Organomation公司）；3k15高速离心机（美国Sigma公司）。

1.2 标准溶液的配制

分别准确称取适量的氯霉素、甲砜霉素和氟苯尼考标准品，甲醇为溶剂，定容于3个50 mL容量瓶中，配制成质量浓度200 μg/mL的母液，各取0.4 mL于50 mL容量瓶中配得1.0 μg/mL的储备液，采用系列稀释法分别配制质量浓度为0.50，1.00，2.00，5.00，10.00和20.00 ng/mL标准工作溶液，于-18 ℃避光保存。

1.3 仪器条件

1.3.1 色谱条件

色谱柱ACQUITY UPLC BEH C18；流速0.3 mL/min；柱温30 ℃；进样量10 μL；流动相A，10%甲醇纯水；B甲醇，梯度洗脱程序见表1。

表1 梯度洗脱程序

1.3.2 质谱条件

质谱条件：离子源采用ESI源，扫描方式采用负离子模式，毛细管电压3.0 kV，离子源温度350 ℃，脱溶剂气温度350 ℃，锥孔反吹气流量50 L/h，脱溶剂气流量900 L/h，驻留时间为60 ms，多反应监测模式（MRM）。

表2 质谱参数

1.4 样品前处理

准确称10.0 g（精确至0.01 g）样品于50 mL离心管中，添加氯霉素内标、10 mL乙腈和2 g 氯化钠，加入1颗陶瓷均质子，加盖振摇，在3 500 r/min条件下的离心机内离心5 min，取3.0 mL上清液转移至5.0 mL的离心管（300 mg无水硫酸镁、100 mg C18、100 mg PSA和50 mg GCB）中，高速离心后，取1.0 mL于40 ℃温度下氮吹至干，加入1.0 mL甲醇水（3+7，V/V）复溶，过0.22 μm有机滤膜，上机检测。

2 结果与分析

2.1 质谱条件的选择

为保证试验结果的准确性，对分析物的母离子、子离子、碰撞能等质谱参数进行优化。采用Q1 Scan方式获取待测物的母离子，在SIM模式下对母离子的去簇电压进行优化。进行Product Ion扫描，得到2个响应较大的子离子，对子离子进行碰撞能量优化，从而优化质谱条件，采用MRM模式对待测物的驻留时间进行优化，使每个化合物的采集点约在15个点左右。在上述优化的LC-MS/MS条件下，质量浓度为1.0 μg/L的氯霉素、甲砜霉素和氟苯尼考，TIC图谱如图1所示。

图1 标准溶液中氯霉素、甲砜霉素和氟苯尼考的总离子流色谱图

2.2 提取剂的优化

乙腈、甲醇和乙酸乙酯是酰胺醇类药物常用的提取剂，添加2 μg/kg的混标对3种溶剂的提取效率进行考察。试验结果表明，水与甲醇无法分开，提取溶液颜色较深；乙酸乙酯可与水分离，但是提取色素较多不利于后续的净化；乙腈为提取剂时，回收率在80.5%～102%之间，加入氯化钠后可与水分层且提取的色素较少，故选乙腈作为提取剂。

2.3 净化剂的选择

PSA、C18和GCB为常用净化剂，PAS可有效去除掉基质中的有机酸、金属离子和部分糖等物质，C18去除非极性化合物，GCB可去除一些非极性色素。探究PSA、GCB和C18用量对酰胺醇类药物回收率的影响。结果发现，PSA和C18为100 mg时，回收率为80.9%～110%，但是上机液的颜色较深；GCB为50 mg时，3种化合物的回收率在90.7%～103%之间，且样品比较澄清。因此采用100 mg PSA、100 mg C18，50 mg GCB作为混合净化剂。

2.4 基质效应

物质在检测的时不可避免受到基质效应影响[14]。对于液质来说，主要是因为杂质与目标物在离子化的过程中发生竞争[15]。为确保试验结果的准确性，对基质效应进行研究。以测定空白海带提取液与溶剂相同的浓度的响应比值作为评价基质效应（ME），当ME越偏离1.0时，基质效应越大，越接近1.0时，基质效应越小[16]。结果表明，氯霉素、甲砜霉素与氟苯尼考的比值分别为0.92，0.94和1.05，这3个化合物受基质效应较小。

2.5 标准曲线、检出限和定量限

用甲醇水（3+7，V/V）稀释储备液配制成质量浓度分别为0.50，1.00，2.00，5.00，10.00和20.00 ng/mL的混合标准溶液作标准曲线，以浓度为横坐标（x），峰面积为纵坐标（y），绘制校准曲线。结果如表3所示，氯霉素、甲砜霉素与氟苯尼考在0.50～20 ng/mL范围内线性良好，相关系数r＞0.999，在空白样品中添加，以信噪比（rSN）=3检出限（rLOD），以最小的添加浓度为定量限（rLOQ），氯霉素、甲砜霉素与氟苯尼考的rLOD分别为0.54，0.12和0.07 μg/kg，rLOQ为1.0 μg/kg。

表3 氯霉素、甲砜霉素与氟苯尼考的线性方程、相关系数、检出限和定量限

2.6 准确度和精密度

分别选取不同基质样品，进行1.0，5.0和10.0 μg/kg的三水平加标试验，结果见表4。氯霉素、甲砜霉素与氟苯尼考在不同基质的3水平加标回收试验中：氯霉素回收率为87.8%～103.4%，SRSD为2.6%～6.7%；甲砜霉素回收率为89.1%～109.5%，SRSD为3.4%～9.5%；氟苯尼考回收率为89.5%～108.3%，SRSD为2.1%～7.3%。结果表明，该方法具有较高的准确度和精密度。