C30色谱柱HPLC法分析测定蔬菜中阿维菌素残留量

林洋，郁蕉竹，许文雅，张宏宏，王韵，刘瀛

沈阳食品药品检验所（沈阳 110136）

阿维菌素类药物（avermectins，AVMs）是由链霉素产生的一组十六元环内酯双糖类化合物，是经过微生物发酵、提取的新型抗生素类杀虫杀螨剂，对螨类和昆虫具有胃毒和触杀作用，是现代农业广泛应用的一种抗寄生虫农药[1-3]。关于阿维菌素的检测方法国内外已有大量报道，张红艳等[4]建立甲醇提取测定黄瓜中阿维菌素残留量。王晓菁等[5]建立酸性乙腈溶液提取来分析枸杞中阿维菌素残留量。此外阿维菌素检测方法还有液质联用法[6-11]、高效液相色谱荧光法[12-14]，但液相质谱法运营成本相对较高，而荧光法前处理又较为复杂繁琐，稳定性差。检测阿维菌素残留量大多使用GB 23200.19—2016《食品安全国家标准 水果和蔬菜中阿维菌素残留量的测定 液相色谱法》，采用C18色谱柱进行色谱分离，但此方法对于基质复杂的蔬菜样品的测定杂质干扰问题较为严重，主峰与杂质峰分离效果不理想[15]。在液相色谱检测阿维菌素残留量中采用C30色谱柱进行色谱分离的方法鲜有报道，试验选用乙腈作为提取溶剂替代国标中的丙酮提取，选用C30色谱柱进行色谱分离，通过优化色谱条件，减少蔬菜基质中杂质峰的背景干扰，从而提高方法的准确性和重复性，优化阿维菌素的高效液相色谱检测方法，为同行业蔬菜中阿维菌素残留量的测定提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 主要材料与试剂

乙腈（色谱纯，赛默飞世尔科技有限公司）；甲醇（色谱纯，赛默飞世尔科技有限公司）；氯化钠（分析纯，国药集团化学制药有限公司）；阿维菌素标准品（100 mg/L，安谱实验科技股份有限公司）；C18固相萃取柱（60 mg，3 mL，安谱实验科技股份有限公司）；Athena C30色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm，安谱实验科技股份有限公司）；试验用水均为一级水；菠菜、大白菜、萝卜、马铃薯、豇豆、小白菜（市购）。

1.2 主要仪器与设备

Waters e2695高效液相色谱仪（配2998二极管阵列检测器，美国Waters公司）；超声波清洗仪（KQ-250DB，昆山市超声仪器有限公司）；德国IKA涡旋混合器；高速冷冻离心机（H1750R，湖南湘仪离心机仪器有限公司）；莱伯泰科多通道平行浓缩仪（M64）；常熟双杰电子天平（JJ600）；Milli-Qreference纯水机（Millipoer SAS公司）；移液器（20～200 μL，705878及100～1 000 μL，705880，普兰德公司）。

1.3 试验条件

1.3.1 样品前处理

蔬菜样品采用四分法取样，经粉碎机绞碎后均匀混合，准确称取10.00 g均匀试样于具塞塑料离心管中，加入10 mL乙腈，涡旋振荡，超声提取30 min，加入3～4 g氯化钠，振荡摇匀，按10 000 r/min离心5 min，取上清液于离心管中，用10 mL乙腈重复提取1次，合并提取液。在40 ℃水浴下氮吹近干。加入1 mL甲醇复溶，涡旋溶解，加入3 mL水涡旋混匀待净化。将固相萃取柱依次用5 mL甲醇活化、5 mL水平衡，将上述溶液完全转入C18固相萃取柱，用5 mL水淋洗小柱，弃去全部淋洗液，最后用5 mL甲醇洗脱并抽干，收集洗脱液，用氮气吹至近干。准确加入0.5 mL甲醇溶解残渣，用0.22 μm有机滤膜过滤，滤液供液相色谱测定，外标法定量。

1.3.2 色谱条件

色谱柱C30柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相为甲醇-水（85∶15，V/V）；流速1.0 mL/min；检测波长245 nm；进样量20 μL；柱温35 ℃；检测器采用二极管阵列检测器。

1.3.3 标准溶液的配制

分别准确移取0.050，0.075，0.100，0.200和0.500 mL质量浓度为100 mg/L的阿维菌素标准溶液于10 mL容量瓶中，加甲醇定容到刻度，轻摇混匀，标准系列工作溶液中阿维菌素的质量浓度分别为0.50，0.75，1.00，2.00和5.00 mg/L。

2 结果与分析

2.1 前处理方法的选择与比较

2.1.1 提取溶剂的选择

已报道的阿维菌素提取溶剂有丙酮[16]、甲醇[17]、乙酸乙酯[18]和乙腈[19-20]溶液等，提取方式包括超声、涡旋、振荡或均质等，试验分别采用丙酮、乙腈、甲醇作为提取剂对样品进行超声提取，发现甲醇和丙酮作为提取剂时基质干扰较多，且样品中水分对下一步净化效果也有影响，因此试验方法采用乙腈提取，并加入氯化钠进行盐析来分离水相有机相，促进目标分析物与有机相融合，该方法有较高提取率同时也减少样品中杂质的提出；且国家标准中使用的丙酮提取剂属易致毒易致爆溶剂，而乙腈毒性和安全性相对丙酮较小。因此通过综合操作安全性简便性、提取效率和净化效果方面，最终选用乙腈作为提取剂。

2.1.2 净化方法的比较

常见净化方法有液-液萃取法、固相萃取小柱净化法等，由于蔬菜样品提取液色泽较深，基质干扰较多，含有大量色素、有机质和盐类，选取最优的分离纯化方法会在最大程度降低样品基质干扰，提高分析方法的准确性和精密度。试验分别测试直提后上样、C18固相萃取净化柱、氨基柱、氧化铝层析柱的净化方法，其中乙腈提取后直接上样基质干扰严重，氧化铝层析柱和氨基柱对基质除杂和回收效果均不理想；试验对比待净化液中甲醇含量对回收效果影响，甲醇含量分别为20%，25%和30%时上样净化的回收率分别为95.2%，97.6%和96.2%，其中用25%甲醇含量的待净化液过净化柱回收率最高。因此该方法采用甲醇含量25%的待净化液过C18固相萃取柱进行净化。

2.2 色谱条件的选择与比较

使用的C18色谱柱大多数都是使用单官能团硅烷化试剂键合形成的单层键合相，也有使用双官能团或三官能团硅烷试剂键合形成的多层键合相，也称为聚合型键合相。C30键合相具有比C18更长的烷基链，有更强的疏水性，在硅胶表面形成致密的多层C30烷基链。由于多层键合相可以形成更为致密的键合层，能更加有效地掩蔽硅胶表面的硅羟基，同时具有更强的溶质保留能力和对强极性物质更小的非特异性吸附，对非极性溶质的保留能力和分辨率更高，具有非常好的分离能力。基于多层聚合型键合相的优势和C30烷基链优异的分离效果，试验以甲醇和水为流动相，以加标菠菜样品为基质，对比C18色谱柱和C30色谱柱及不同流动相比例条件下的中阿维菌素与杂质峰的分离效果，见图1～图5。图谱表明，使用C30色谱柱分离菠菜基质中阿维菌素效果明显优于C18色谱柱，其中采用C30色谱柱、甲醇-水（85∶15，V/V）作为流动相时，阿维菌素主峰与杂质峰分离度R＞1.5，分离效果最佳，杂质干扰最小。

图1 C18色谱柱、甲醇-水（90∶10，V/V）为流动相分离菠菜基质中阿维菌素色谱图

图2 C18色谱柱、甲醇-水（85∶15，V/V）为流动相分离菠菜基质中阿维菌素色谱图

图3 C30色谱柱、甲醇-水（90∶10，V/V）为流动相分离菠菜基质中阿维菌素色谱图

图4 C30色谱柱、甲醇-水（85∶15，V/V）为流动相分离菠菜基质中阿维菌素色谱图

图5 C30色谱柱、甲醇-水（85∶15，V/V）为流动相阿维菌素标准品色谱图

2.3 线性关系和定量限

在上述试验条件下测定0.50，0.75，1.00，2.00和5.00 mg/L系列质量浓度的阿维菌素标准溶液，以峰面积为纵坐标，质量浓度为横坐标绘制线性关系曲线，得到的线性方程为Y=40 800X-355，其中r2值为0.999 8，结果表明在0.50～5.00 mg/L范围内有良好的线性关系。配制适当浓度的阿维菌素标准溶液，在上述条件下平行测定6次，按照rSN=10计算得出方法定量限为0.01 mg/kg，满足食品安全国家标准GB 23200.19—2016要求。

2.4 准确度和精密度

在菠菜样品空白基质中分别添加0.01，0.05和0.10 mg/kg的阿维菌素标准品，按照上述试验条件进行加标回收试验，每个加标水平重复测定6次，外标法定量测得阿维菌素的平均回收率和相对标准偏差（SRSD），结果见表1。阿维菌素的加标平均回收率为93.7%～97.5%，其SRSD值为1.1%～2.2%，满足GB/T 27404—2008《实验室质量控制规范 食品理化检测》要求，且方法具有良好的重复性。

表1 回收率与相对标准偏差（n=6）

2.5 蔬菜样品参考分析

随机选取大白菜、萝卜、马铃薯、豇豆、小白菜5种实际蔬菜样品，在基质中分别添加0.05 mg/kg的阿维菌素标准品，按上述测试条件进行加标回收试验，试验结果见表2。测得5种蔬菜样品中阿维菌素含量的回收率为92.8%～102.4%，SRSD值为1.1%～4.5%（n=6），回收率和精密度均满足试验要求。

表2 实际样品中阿维菌素残留量回收率和精密度试验结果（n=6）

3 结论

建立蔬菜中阿维菌素残留量分析检测的高效液相色谱法，前处理方面采用乙腈进行超声提取，盐析分离，SPE小柱固相进行萃取，减少色素和脂质的吸附，与国家标准中采用丙酮提取前处理方法相比，毒性小、操作简便快捷、基质干扰影响小；仪器测定方面采用二极管阵列检测器，普及率高，结果定量准确，试验方法选用C30色谱柱进行色谱分离纯化，由于C30键合相具有比C18更长的烷基链，具有更好的分离效果，通过有效调节流动相比例最大限度降低基质干扰峰的影响。试验结果表明在0.50～5.00 mg/L范围内阿维菌素色谱峰面积与质量浓度之间有良好线性关系，准确度高，蔬菜样品中阿维菌素0.05 mg/kg水平加标回收率可达92.8%～102.4%；重复性好，相对标准溶液偏差为1.1%～4.5%（n=6），试验优化标准方法，降低基质干扰，具有较强的可操作性，稳定性好，可有效适用于蔬菜中阿维菌素残留的定量分析，满足日常检测需求，为阿维菌素残留量的快速检测提供参考依据，便于在基层实验室推广使用，为保障果蔬质量安全检测提供技术支撑。