促进超声波场中木瓜蛋白酶活力的工艺优化

徐轲鹏 ，赵静，唐月梅，王立博，邹强，文永平*

1.成都大学食品与生物工程学院（成都 610016）；2.四川省轻工业研究设计院有限公司（成都 610000）

木瓜蛋白酶是一种半胱氨酸蛋白酶，对蛋白质底物具有较强的水解能力[1]，因为其安全性高、易获取、热稳定性强，在外源蛋白水解酶类市场中占据十分重要的地位[2]。木瓜蛋白酶用途广泛，可作肉类嫩化剂、啤酒品质改良剂、营养保健食品等[3]，根据2017年酶类市场的研究报道，其在食品加工方面的应用显著领先其他植物来源的外源蛋白水解酶，并且其应用范围有进一步扩展的趋势[4]。李志远等[5]通过对解冻过程中冻肉显微结构的观察发现，解冻温度15 ℃左右时冻肉解组织恢复较好，食用品质高，但木瓜蛋白酶适宜反应温度较高，常温（20 ℃）条件下催化活力不足最适温度的10%，在一定程度上限制了木瓜蛋白酶在食品工业中的应用[6]。Fruton等[7]利用合成肽为底物，证明游离半胱氨酸可以显著提高木瓜蛋白酶活力。Homaei等[8]通过酶动力学研究再次验证，由一定量的半胱氨酸与木瓜蛋白酶形成的共固定化酶，相比单独固定化木瓜蛋白酶，在低温下具有较高的活性和稳定性。超声波作为一种新兴物理手段，在食品工业应用广泛[9]。黄六容等[10]通过试验发现，用超声波处理木瓜蛋白酶，其活力比对照组高9%，但随超声波处理时间的增加，其活力反而降低14.5%。

超声波技术和游离半胱氨酸单独对木瓜蛋白酶活力的影响被广泛研究，两者在较低温度下对木瓜蛋白酶的活力都有一定增强效果。但超声波协同半胱氨酸对木瓜蛋白酶活力的影响鲜有报道。鉴于此，试验固定初始处理温度20 ℃，以木瓜蛋白酶活力为评价指标，探讨半胱氨酸及超声波对其影响，在单因素试验结果基础上，应用响应面法分析超声波时间、超声波功率与游离半胱氨酸对木瓜蛋白酶活力的影响，探究最佳工艺参数，为木瓜蛋白酶在肉制品中的高效利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.2 仪器与设备

DHP-9162D恒温恒湿培养箱（上海齐欣科学仪器有限公司）；SB-5200DTDN超声波清洗机（宁波新芝生物科技有限公司）；UV1810S分光光度计（上海佑科仪器仪表有限公司）；Centrifuge 5804冷冻离心机（德国Eppendorf公司）；HMS-901D磁力搅拌器（博大精科仪器厂）；HH-6恒温水浴锅（国华电器有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 试验前处理

将0.1%的木瓜蛋白酶溶液置于超声波清洗机内，一起放置于恒温培养箱中，确保试验在（20±0.1）℃的条件下进行。

1.3.2 测定木瓜蛋白酶活力

根据张新灿等[11]的方法，略作修改。准确移取0.2 mL木瓜蛋白酶液及2.2 mL 1 g/100 mL酪蛋白，在0.1 mol/L的三羟甲基氨基甲烷-HCl缓冲溶液（pH 8.5）中均匀混合，40 ℃恒温水浴锅中反应20 min，立即加入3.6 mL 10%的三氯乙酸溶液。以在木瓜蛋白酶液与酪蛋白底物混合之前加入三氯乙酸作为空白。反应结束后，将混合液于6 570×g离心力下离心20 min，取上清液，测定其280 nm处的吸光度。根据酪氨酸标准曲线和测定的吸光度，计算反应液中酪氨酸含量。木瓜蛋白酶活力可用1 mL木瓜蛋白酶液在1 min内分解酪蛋白后的酪氨酸含量表示，单位为U/mL。

1.3.3 单因素试验

固定条件：木瓜蛋白酶用量0.1%、反应初始温度20 ℃。设定超声波功率、超声波时间、游离半光氨酸添加量3个因素，单因素试验条件：（1）超声波时间30 min，游离半胱氨酸添加量10 mmol/L，超声波功率为50，100，150，200和250 W；（2）超声波功率100 W，游离半胱氨酸添加量10 mmol/L，超声波时间为10，20，30，40和50 min；（3）超声波功率100 W，超声波时间30 min，游离半胱氨酸添加量为5，10，15，20和25 mmol/L。

随后，徐渭又指出，虽然南戏无宫调系统，但其曲牌在宋元时期已经形成了固定套路的衔接顺序：“南曲固无宫调，然曲之次第，须用声相邻以为一套，其间亦自有类辈，不可乱也。如【黄莺儿】则继之以【簇御林】，【画眉序】则继之以【滴溜子】之类，自有一定之序，作者观于旧曲而遵之可也。”[14](P241)可见，徐渭倡导从古戏文本中找寻直接线索，以宋元南戏旧篇中的实例来排列、归纳“曲之次第，须用声相邻以为一套”[14](P241)的具体顺序，完全是重视实证的理性研究路线。

1.3.4 响应面优化试验设计

在单因素试验基础上，以Box-Behnken中心试验设计原理，对影响木瓜蛋白酶活力的超声波功率（A）、超声波时间（B）和游离半胱氨酸添加量（C）3个因素，使用Design-Expert 8.0.6软件设计试验方案进行优化，对拟合方程进行方差分析和显著性检验，各试验组编码如表1所示。

表1 响应面试验因素水平编码

1.3.5 数据处理

运用SPSS 19.00软件分别对以上试验结果进行方差和显著性分析，Turkey法进行多重比较，Design-Expert 8.0.6进行三因素三水平响应面设计及数据数据分析，Origin 8.0作图，在无特殊说明的情况下，所有测试结果一式三份。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果与分析

2.1.1 超声波功率对木瓜蛋白酶活力的影响

超声波时间和游离半胱氨酸添加量分别为30 min和10 mmol/L时，超声波功率在50～250 W范围内的木瓜蛋白酶活力变化如图1所示。随着超声波功率的增加，木瓜蛋白酶活力逐渐增强，在100 W时达到最大值。木瓜蛋白酶活力的提高可能是因为超声波功率的增大加速反应溶液的振荡，使木瓜蛋白酶与底物的接触更彻底，其相互作用加强[12]。超声波功率大于100 W之后，酶活力慢慢降低，但总体趋势较为平缓，没有表现出显著性差异。

图1 超声波功率对木瓜蛋白酶活力的影响

2.1.2 超声波时间对木瓜蛋白酶活力的影响

超声波功率和游离半胱氨酸添加量分别为100 W和10 mmol/L时，超声波时间在10～50 min范围内的木瓜蛋白酶活力变化如图2所示。随着超声波时间的延长，木瓜蛋白酶活力变化趋势总体上呈先增大后减小，超声波时间对木瓜蛋白酶活力有极显著影响（P＜0.01）。木瓜蛋白酶活力在30 min时达到最大值，引起该结果的原因可能在于超声波空化效应产生各种综合作用，如瞬间高压、微观射流和剪切应力等使木瓜蛋白的酶催化活性中心暴露，与作用底物充分结合，导致酶催化活力显著增强[13]。随着超声波时间继续延长，水分子裂解，反应溶液中出现大量·OH和·OOH等自由基，酶分子与这些自由基相互作用，导致木瓜蛋白酶空间结构发生改变，酶活力大幅下降甚至可能失活[14]。

图2 超声波时间对木瓜蛋白酶活力的影响

2.1.3 游离半胱氨酸添加量对木瓜蛋白酶活力的影响

超声波功率和超声波时间分别为100 W和30 min时，游离半胱氨酸添加量在5～25 mmol/L范围内的木瓜蛋白酶活力变化如图3所示。随着游离半胱氨酸添加量的增加，木瓜蛋白酶活力变化趋势总体上呈先增大后减小，游离半胱氨酸添加量对木瓜蛋白酶活力有极显著影响（P＜0.01）。游离半胱氨酸添加量10 mmol/L时，木瓜蛋白酶活力达到峰值。半胱氨酸是木瓜蛋白酶的激活剂，在多项研究中被证明[15]。游离半胱氨酸激活木瓜蛋白酶的能力与其浓度有直接关系，此现象在早期研究中已表明[16]。10～25 mmol/L时木瓜蛋白酶活力明显下降的原因可能是过高浓度的游离半胱氨酸会阻碍酶与底物的结合，导致酶活力降低，催化反应速率减慢。

图3 游离半胱氨酸添加量对木瓜蛋白酶活力的影响

2.2 响应面试验结果与分析

2.2.1 模型建立与数据分析

基于单因素试验分析，根据单因素试验结果，选择合适的超声波功率（A）、超声波时间（B）和游离半胱氨酸添加量（C）条件进行响应面优化试验，试验方案和结果如表2所示。

2.2.2 回归模型的建立及方差分析

使用Design-Expert 8.0.6软件对表2中各项数据进行多元拟合，得到方程：Y=34.20+0.090A+0.21B+0.75C+0.027AB-0.083AC-0.16BC-1.23A2-1.38B2-0.73C2。

表2 Box-Behnken试验设计与结果

对该模型进行显著性检验，由表3可知：回归模型P＜0.01，拟合检验显著；失拟项P=0.576 9＞0.05，失拟检验不显著，因此，该模型可以很好描述各因素对木瓜蛋白酶活力的相互影响，可以使用该模型对试验进行模拟。决定系数R2=0.995 7，说明此模型极显著；校正决定系数Radj2=0.990 2，表示试验纯误差不显著，可以用该模型进行试验。分析模型中的各项系数可知：因素B、因素C表现极显著（P＜0.01）；交互项BC表现显著（P＜0.05）；二次项A2、B2、C2表现均极显著（P＜0.01）。试验中，因素A、B、C的F值分别为4.51，23.42和313.53，表明对木瓜蛋白酶活力的影响顺序为游离半胱氨酸添加量（C）＞超声波时间（B）＞超声波功率（A）。

表3 回归模型及方差分析

2.2.3 响应面分析

图4是响应值对各因素两两交互作用构成的三维曲面图，对响应面曲面图和等高线进行对比分析可知，超声波时间与游离半胱氨酸添加量交互作用的响应面凸起程度大于其他因素的交互作用，表示超声波时间与游离半胱氨酸添加量对木瓜蛋白酶活力的交互影响最大。这与表3中的方差分析结果一致（P＜0.05）。

图4 各因素的响应面及等高线图

2.2.4 最佳参数值的确定及验证

经回归模型分析，得到超声波协同半胱氨酸提高木瓜蛋白酶活力的最佳条件：木瓜蛋白酶用量0.1%、初始处理温度20 ℃、超声波功率100.97 W、超声波时间30.45 min、游离半胱氨酸添加量12.56 mmol/L。此条件下木瓜蛋白酶活力为34.40 U/mL。从试验的操作性考虑，将各参数值进行适当的调整，最终确定条件：木瓜蛋白酶用量0.1%、起始处理温度20 ℃、超声波功率100 W、超声波时间30 min、游离半胱氨酸添加量12 mmol/L，用此条件进行3次平行试验，最终结果为34.32 U/mL，此结果与模型预估值接近，表明运用响应面法优化所得结果合理可靠。

3 结论

试验探讨超声波及半胱氨酸对木瓜蛋白酶活力的影响，通过响应面法得到提高木瓜蛋白酶活力的最佳工艺条件并进行验证。在3个因素中，影响木瓜蛋白酶活力的强弱顺序为游离半胱氨酸添加量＞超声波时间＞超声波功率。提高木瓜蛋白酶活力的最优条件为木瓜蛋白酶用量0.1%，初始处理温度20 ℃，超声波功率100.97 W，超声波时间30.45 min，游离半胱氨酸添加量12.56 mmol/L。此时，木瓜蛋白酶活力为34.40 U/mL。

综上所述，利用超声波辅助半胱氨酸可以有效提高木瓜蛋白酶活力，改善木瓜蛋白酶在常温下酶活力不高的问题。试验结果为木瓜蛋白酶在肉制品加工中的高效利用提供数据支撑。