不同炮制方法对菟丝子醇提物中总黄酮、总多糖及7种成分的影响

赵唯年，潘新波，赵丽娟，王艳红，刘玉婷，贾忠，.甘肃农业大学动物医学院，甘肃 兰州 730070；.兰州市第二人民医院，甘肃 兰州 730046

菟丝子为旋花科植物南方菟丝子Cuscuta australisR.Br.或菟丝子Cuscuta ChinensisLam.的干燥成熟种子，味辛、甘，性平，归肝、肾经，具有补益肝肾、固精缩尿、安胎、明目、止泻功效，用于肝肾不足、阳痿遗精、遗尿尿频等[1-2]。菟丝子质坚实，不易粉碎，有效成分不易溶出，临床多用其炮制品。历代菟丝子炮制方法较多，如盐炙、酒炙、清炒、制饼等。2020年版《中华人民共和国药典》收载的菟丝子炮制品为盐菟丝子。菟丝子主要含有酚酸、黄酮、多糖、生物碱、甾醇、氨基酸及微量元素等[3-5]，其中黄酮类和酚酸类化合物是其主要有效成分[6-7]。黄酮类和多糖是菟丝子中研究较多的化学成分，其中金丝桃苷、紫云英苷、槲皮素、异鼠李素等具有多种药理活性，菟丝子总黄酮具有改善实验性心肌缺血、调节机体免疫、刺激内分泌等多种功能[7-8]，菟丝子多糖具有降血糖、保护脑组织及抗衰老等作用，是发挥补益作用的重要物质基础[8-9]。目前相关研究主要集中在质量控制、不同炮制品中有效成分含量测定、提取工艺及药理作用的利用与开发[10-14]，而不同炮制方法对菟丝子炮制品整体质量评价及炮制前后化学成分差异变化研究报道较少。本试验测定菟丝子不同炮制品醇提物中总黄酮、总多糖及7种主要药效成分绿原酸、芦丁、金丝桃苷、紫云英苷、槲皮素、山柰酚和异鼠李素的含量，建立菟丝子生品及炮制品（清炒品、酒炙品、盐炙品、制饼品）HPLC指纹图谱，结合化学计量学，分析菟丝子炮制前后化学成分的变化规律及差异性，为菟丝子及炮制品的质量控制评价及炮制机理研究提供参考。

1 仪器与试药

Agilent 1260 高效液相色谱仪（G1311C 四元泵，G1329B自动进样器，G1316A柱温箱，G1315D DAD检测器），美国Agilent公司；Agilent openLAB control panel化学工作站，美国Agilent公司；752Pro紫外可见分光光度计，上海棱光技术有限公司；RE-52A旋转蒸发器，上海亚荣生化仪器厂；XPE105十万分之一电子天平，瑞士METTLER TOLEDO 公司；TH-600BQG数控超声波清洗机，济宁天华超声电子仪器有限公司。

对照品绿原酸（批号B20782）、芦丁（批号B20771）、金丝桃苷（批号B20631）、紫云英苷（批号B21704）、槲皮素（批号B20527）、山柰酚（批号B21126）、异鼠李素（批号B21554），上海源叶生物科技有限公司，质量分数≥98%。菟丝子药材，兰州安泰堂中药饮片有限公司，符合2020年版《中华人民共和国药典》（一部）规定；乙腈、甲醇均为色谱纯，天津科密欧化学试剂有限公司；其余试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 样品制备

2.1.1 样品预处理

取菟丝子原药材，除杂，干净干燥，菟丝子药材分为5组，每组约100.0 g，密闭备用。

2.1.2 生品

称取净制菟丝子药材，密闭保存备用。

2.1.3 清炒品

称取净制菟丝子药材，置炒制容器内，用文火加热，炒至表面微黄，有爆裂声，取出放凉，密闭保存备用[15]。

2.1.4 盐炙品

称取净制菟丝子药材，加盐水拌匀，闷润2 h，待盐水吸尽后，置炒制容器内，用文火加热，炒至略鼓起，微有爆裂声，香气溢出时，取出放凉，密闭备用[15]。

2.1.5 酒炙品

称取净制菟丝子药材，加黄酒拌匀，闷透2 h，待黄酒吸尽后，置炒制容器内，用文火加热，炒至表面微变黄，取出放凉，密闭备用[15]。

2.1.6 制饼品

称取净制菟丝子药材，加适量水（6倍量）煮至开裂，不断搅拌，待水吸尽后，全部呈黏丝稠粥状时，取出，放置过夜，压饼，干燥，密闭备用。

2.1.7 样品提取

分别精密称取上述菟丝子生品及炮制品各约50.0 g，加60%乙醇500 mL，水浴回流提取2次，第1次45 min，第2次30 min，抽滤，合并，浓缩蒸干，得浸膏备用，分别计算各样品的醇提浸膏得率。结果显示，菟丝子生品、盐炙品、清炒品、酒炙品、制饼品醇提浸膏得率分别为7.82%、10.12%、9.30%、9.32%、10.77%，表明炮制方法对菟丝子醇提物中化学成分的溶出具有促进作用。

2.2 总黄酮含量测定

2.2.1 对照品溶液制备

精密称定芦丁对照品适量，加60%乙醇制成浓度为0.981 mg/mL的对照品溶液，即得。

2.2.2 供试品溶液制备

精密称取各菟丝子生品及炮制品干燥浸膏约0.1 g，置100 mL锥形瓶中，精确加入60%乙醇50 mL完全溶解，称定质量，超声提取（功率250 W，频率30 kHz）1 h，冷却至室温，用60%乙醇补足减失的质量，即得。

2.2.3 线性关系考察

精密吸取“2.2.1”项下芦丁对照品溶液0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL，分别置于10 mL具塞试管中，加入5%NaNO2溶液0.5 mL，混匀静置，加入5%Al(NO3)3溶液0.5 mL，混匀静置6 min，加入4%NaOH溶液4.0 mL，用60%乙醇定容至10 mL，放置15 min，于波长510 nm处测定吸光度值。以芦丁质量（mg）为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线，得回归方程Y=1.017 3X-0.007 2（r=0.999 6），结果显示，芦丁对照品在0.098 1～0.981 mg范围内与吸光度值线性关系良好。

2.2.4 精密度试验

精密吸取1.0 mL菟丝子生品供试品溶液6份，按“2.2.3”项下方法测定，结果显示吸光度RSD=0.84%，表明该方法精密度良好。

2.2.5 稳定性试验

精密吸取1.0 mL 菟丝子生品供试品溶液，按“2.2.3”项下方法，分别于0、10、20、40、60、90 min测定，结果显示吸光度RSD=2.54%，表明供试品溶液在90 min内稳定性良好。

2.2.6 重复性试验

分别精确称取菟丝子生品各6份，按“2.1.7”项下方法提取，所得干燥浸膏按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.2.3”项下方法进行测定，结果显示吸光度RSD=2.55%，表明该方法重复性良好。

2.2.7 加样回收率试验

分别精确称取6份菟丝子生品醇提物浸膏适量，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，分别吸取1.0 mL已知含量供试品溶液置具塞试管中，分别加入0.3 mL芦丁对照品溶液，按“2.2.3”项下方法测定，结果显示，平均回收率为97.62%，RSD=2.01%。

2.2.8 样品测定

精密吸取“2.2.2”项下各供试品溶液1.0 mL，按“2.2.3”项下方法测定吸光度，平行3次，计算总黄酮含量。结果菟丝子生品、盐炙品、清炒品、酒炙品、制饼品的总黄酮含量分别为0.828 6%、0.869 0%、1.110 9%、1.330 5%、1.174 1%。与生品比较，各炮制品中总黄酮含量明显较高，依次为酒炙品>制饼品>清炒品>盐炙品>生品，酒炙品总黄酮含量约为生品的1.6倍。表明各炮制方法对菟丝子醇提物中总黄酮的溶出具有促进作用。

2.3 总多糖含量测定

2.3.1 对照品溶液制备

精密称定无水葡萄糖对照品适量，加蒸馏水制成浓度为0.001 049 g/mL对照品溶液。

2.3.2 供试品溶液配制

精密称取菟丝子生品及炮制品干燥浸膏约1.0 g，置于250 mL锥形瓶，使含醇量达80%。静置过夜，离心后将沉淀用蒸馏水溶解，按Sevage法（氯仿∶正丁醇=4∶1）除蛋白，重复以上操作3次。离心后将沉淀用20 mL蒸馏水溶解，吸取1 mL溶液定容至50 mL容量瓶中，即得。

2.3.3 线性关系考察

分别吸取0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL对照品溶液，用蒸馏水补足至1.0 mL，置具塞试管中，加入5%苯酚溶液0.5 mL，混匀后迅速加入2.5 mL浓硫酸振荡，充分混合后将试管置于沸水浴中反应15 min。于波长490 nm处测吸光度，以无水葡萄糖质量（g）为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线，得回归方程Y=1 420.6X-0.013 2（r=0.999 5），结果显示，无水葡萄糖在0.000 104 9～0.001 049 g范围内与吸光度值线性关系良好。

2.3.4 精密度试验

精密吸取1.0 mL菟丝子生品供试品溶液6份，按“2.3.3”项下方法测定，结果显示吸光度RSD=1.22%，表明该方法精密度良好。

2.3.5 稳定性试验

精密吸取1.0 mL 菟丝子生品供试品溶液，按“2.3.3”项下方法，分别于0、10、20、40、60、90 min测定，结果显示吸光度RSD=1.98%，表明供试品溶液在90 min内稳定性良好。

2.3.6 重复性试验

分别精确称取菟丝子生品各6份，按“2.1.7”项下提取，所得干燥浸膏按“2.3.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.3.3”项下方法测定，结果显示吸光度RSD=2.02%，表明该方法重复性良好。

2.3.7 加样回收率试验

分别精确称取6份菟丝子生品醇提物浸膏适量，按“2.3.2”项下方法制备供试品溶液，分别吸取1.0 mL已知含量供试品溶液置具塞试管中，分别加入0.1 mL无水葡萄糖对照品溶液，按“2.3.3”项下方法测定，结果显示，平均回收率为103.33%，RSD=2.56%。

2.3.8 样品测定

精密吸取“2.3.2”项下各供试品溶液1.0 mL，按“2.3.3”项下方法测定吸光度，平行3次，计算总多糖含量。结果菟丝子生品、盐炙品、清炒品、酒炙品、制饼品的总多糖含量分别为1.160 1%、3.296 1%、2.343 6%、2.515 6%、3.589 3%。与生品比较，各炮制品中总多糖含量明显较高，依次为制饼品>盐炙品>酒炙品>清炒品>生品，制饼品总多糖含量约为生品的3.1倍。表明各炮制方法对菟丝子醇提物中总多糖的溶出具有促进作用。

2.4 7种成分含量测定

2.4.1 对照品溶液制备

分别精密称取绿原酸、芦丁、金丝桃苷、紫云英苷、槲皮素、山柰酚、异鼠李素对照品适量，用甲醇配制成浓度分别为0.013 845、0.039 3、0.251 2、0.001 94、0.030 3、0.000 49、0.000 195 mg/mL的混合对照品溶液，摇匀，即得，4 ℃保存，备用。

2.4.2 供试品溶液制备

精密称取“2.1”项下制备的菟丝子清炒品醇提浸膏约0.1 g，置100 mL锥形瓶中，加入50%甲醇50 mL溶解，超声（250 W，30 kHz）提取20 min，冷却至室温，用50%甲醇补足减失的质量，即得，4 ℃保存。

2.4.3 色谱条件

采用Phenonmenex Luna C18 色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流动相为乙腈（A）-0.1%磷酸水（B），梯度洗脱（0～20 min，17%～23%A；20～40 min，23%～40%A；40～60 min，40%～60%A），柱温30 ℃，流速1 mL/min，进样量10.0µL，检测波长360 nm，理论塔板数5 000。色谱图见图1。

图1 菟丝子清炒品醇提物HPLC图

2.4.4 线性关系考察

取混合对照品溶液，依次进样0.5、5、10、15、25、35 μL，以进样量为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，得绿原酸、芦丁、金丝桃苷、紫云英苷、槲皮素、山柰酚和异鼠李素的回归方程及线性范围，见表1。

表1 7种成分线性关系考察结果

2.4.5 精密度试验

吸取混合对照品溶液适量，按“2.4.3”项下色谱条件连续进样6次，测定各对照品峰面积和保留时间。结果显示，绿原酸、芦丁、金丝桃苷、紫云英苷、槲皮素、山柰酚和异鼠李素峰面积RSD分别为0.08%、0.13%、0.16%、0.20%、0.09%、0.14%、0.10%，保留时间RSD 分别为0.11%、0.15%、0.10%、0.10%、0.08%、0.13%、0.07%，表明仪器精密度良好。

2.4.6 稳定性试验

吸取“2.4.2”项下菟丝子清炒品溶液，按“2.4.3”项下色谱条件，分别于0、2、4、8、12、24、48 h测定峰面积并计算。结果显示，供试品溶液中绿原酸、芦丁、金丝桃苷、紫云英苷、槲皮素、山柰酚和异鼠李素的峰面积RSD 分别为2.16%、1.77%、1.01%、1.88%、0.73%、0.69%、0.94%，表明供试品溶液在48 h内稳定性良好。

2.4.7 重复性试验

分别精确称取菟丝子清炒品醇提物各0.1 g，平行6份，按“2.4.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.4.3”项下色谱条件测定。结果显示，6份菟丝子清炒品醇提物供试品溶液中绿原酸、芦丁、金丝桃苷、紫云英苷、槲皮素、山柰酚和异鼠李素峰面积RSD分别为1.66%、2.05%、1.77%、1.54%、2.02%、1.88%、1.03%，表明该方法重复性良好。

2.4.8 加样回收率试验

按“2.1”项下方法制备6份菟丝子清炒品醇提物，精密称取0.1 g置100 mL锥形瓶，分别按各成分100%浓度加入绿原酸、芦丁、金丝桃苷、紫云英苷、槲皮素、山柰酚和异鼠李素对照品溶液，按“2.4.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.4.3”项下色谱条件进样测定，计算回收率。结果显示，绿原酸、芦丁、金丝桃苷、紫云英苷、槲皮素、山柰酚和异鼠李素的平均回收率分别为97.20%、99.05%、103.55%、100.11%、98.82%、104.41%、 99.09%，RSD 分别为 1.01%、1.82%、1.42%、1.36%、2.34%、0.75%、1.05%。

2.4.9 样品含量测定

精密称取菟丝子生品及各炮制品醇提物各约0.1 g，按“2.4.2”项下方法制备各供试品溶液，按“2.4.3”项下色谱条件进样测定，结果见表2。各炮制品中绿原酸、芦丁、金丝桃苷和槲皮素含量与菟丝子生品差异明显，各炮制品中绿原酸、槲皮素及山柰酚含量均较生品有所增加；清炒品中芦丁含量明显降低，但槲皮素含量明显高于生品，这一现象可能与清炒过程中芦丁随温度升高分解成槲皮素有关。盐炙品、酒炙品和制饼品中除紫云英苷外，绿原酸、芦丁、金丝桃苷、槲皮素、山柰酚含量均高于生品。盐炙品和酒炙品中上述7种成分的含量高于其他炮制品，表明二者具有促进有效成分溶出的作用。

表2 菟丝子生品及不同炮制品醇提物中7种成分含量（mg/g，n=3）

2.5 指纹图谱建立与分析

2.5.1 共有峰标定及相似度计算

按“2.4.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.4.3”项下色谱条件测定，将图谱导入国家药典委员会《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》（2012A版）进行分析，选取重复性和稳定性好、分离度高的色谱峰进行匹配，共标定17个共有峰，见图2。经与对照品谱图比对，指认1～7号峰分别为绿原酸、芦丁、金丝桃苷、紫云英苷、槲皮素、山柰酚和异鼠李素。指纹图谱相似度评价结果见表3。菟丝子生品与炮制品相似度均不小于0.9，表明不同炮制品化学组成一致性较好。

图2 菟丝子生品及不同炮制品醇提物HPLC指纹图谱

表3 菟丝子生品及炮制品醇提物指纹图谱相似度分析（r）

2.5.2 化学计量学分析

2.5.2.1 主成分分析

采用SPSS20.0软件对指纹图谱17个共有峰峰面积进行标准化处理后，进行主成分分析（PCA），主成分特征值、累计贡献率见表4。共提取2个特征值>1的主成分，累计方差贡献率为92.074%，表明前2个主成分可代表指纹图谱共有峰中大部分化学成分信息和差异信息。主成分载荷矩阵见表5，第1主成分主要反映了10、9、8、11、14、17、15、13、紫云英苷、金丝桃苷、芦丁的峰信息，第2主成分中12、异鼠李素、16、芦丁、13、金丝桃苷、17、15号峰的载荷因子较高。因子得分系数矩阵见表6，紫云英苷和异鼠李素分别在第1、2主成分中因子得分系数最高。将上述标准化处理后的17个共有峰峰面积数据导入SIMCA14.1软件，PCA得分散点图和载荷图见图3。可以看出，菟丝子不同炮制品区分度较为明显，表明不同炮制方法对菟丝子中化学成分影响较大，且PCA结果与指纹图谱分析结果较为一致。

图3 菟丝子指纹图谱共有峰PCA得分散点图和载荷图

表4 菟丝子指纹图谱共有峰主成分特征值及方差贡献率

表5 菟丝子指纹图谱共有峰主成分载荷矩阵

表6 菟丝子指纹图谱共有峰主成分因子得分系数矩阵

2.5.2.2 正交偏最小二乘-判别分析

将17个共有峰峰面积数据导入SIMCA14.1软件，进行正交偏最小二乘-判别分析（OPLS-DA），得分散点图及载荷图见图4。结果显示各炮制品差异明显，区分度高。变量重要性投影（VIP）见图5。以VIP>1.0为条件，筛选出7个差异标志物，依次为山柰酚>异鼠李素>绿原酸>12号峰>16号峰>金丝桃苷>紫云英苷，上述化合物对区分菟丝子不同炮制品影响较大。OPLSDA结果与PCA及指纹图谱具有较高一致性。

图4 菟丝子指纹图谱共有峰OPLS-DA得分散点图和载荷图

图5 菟丝子不同炮制品醇提物共有峰OPLS-DA VIP图

3 讨论

目前菟丝子主要炮制加工方法有盐炙、清炒、酒炙及制饼等。近年来研究表明，菟丝子生品与其炮制品中的化学成分有较大差异[8，13-14]。本研究结合前期预试验，从整体性角度出发，测定菟丝子发挥药理作用的总黄酮、总多糖含量，并以7种主要药效物质分析评价不同炮制方法的影响，结果显示菟丝子炮制后可提高醇提物浸膏得率，总黄酮和总多糖含量均高于生品。各炮制品中绿原酸、芦丁、金丝桃苷和槲皮素含量变化与菟丝子生品差异明显，盐炙和酒炙对菟丝子中7种成分的溶出具有促进作用。

预试验比较了水和乙醇（40%、60%、80%）作为提取溶剂对菟丝子总黄酮、总多糖及特征性成分含量测定的影响，结果表明60%乙醇的总提取效率最高，故选择60%乙醇作为提取溶剂。

菟丝子主要含有黄酮和酚酸类化合物，依据其性质，本研究分别考察了不同流动相体系、流速、检测波长、柱温条件下，对色谱峰峰形、分离度的影响，结果以乙腈-0.1%磷酸水为流动相，检测波长360 nm，流速1 mL/min，柱温30 ℃，进行梯度洗脱，色谱图基线平稳，色谱峰吸收值较大，干扰最少，分离度高。

与生品比较，菟丝子清炒品中芦丁含量明显降低，槲皮素含量明显升高，可能与炒制过程中使芦丁、金丝桃苷等黄酮类分解有关；炮制品中绿原酸含量明显升高，盐炙、清炒、酒炙和制饼过程中，温度在短时间内快速升高，从而使绿原酸相对稳定，增大了在醇溶液中的溶解度；盐炙品和酒炙品中黄酮类成分含量均升高，且酒炙品黄酮类成分含量稍高于盐炙品，上述含量分析结果与肖岚等[16]研究结果具有一致性，可为相关研究提供印证参考。

通过对菟丝子生品及炮制品HPLC指纹图谱分析，共识别标定17个共有峰，鉴别指认7种化合物。相似度分析结果表明，菟丝子炮制前后整体化学成分具有较好的一致性，但药效化学成分含量有显著差异。PCA和OPLS-DA表明，不同炮制方法对菟丝子中山柰酚、异鼠李素、绿原酸、12号峰、16号峰、金丝桃苷、紫云英苷7个差异标志物影响较大。

本研究建立了菟丝子不同炮制品醇提物中多成分含量测定方法，通过分析菟丝子不同炮制品HPLC指纹图谱，可为菟丝子及炮制品的质量评价和探讨菟丝子炮制前后化学成分的变化规律提供参考。